6. Bố cục uận văn
1.9.MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY CHÈ DÂY TẠI VIỆT
NAM
Từ nă 1990 đến na đã c ột số công trình nghiên cứu về cây chè Dây ở trong nư c như sau:
Luận án Tiến sỹ Y học của Vũ Na v i đề tài “Góp phần nghiên cứu tác
dụng của chè Dây trong điều trị loét hành tá tràng” nă 1995 [7].
Luận án Phó Tiến sỹ ược học của Phùng Th Vinh v i đề tài “Nghiên cứu về
thực vật, hóa học và tác dụng sinh học của cây chè Dây” nă 1995 [13].
Luận văn Thạc sỹ y học của Nguyễn Th Tuyết Lan “ Đánh giá tác dụng điều trị loét hành tá tràng có Helicobacter Pylori của nhóm thuốc AMPELOP -
METRONIDAZOL - AMOXICILLIN” nă 1999 [5].
Luận văn Thạc sỹ ược học của Vư ng Th Hồng Vân v i đề tài “Nghiên cứu
chè Dây Sapa Ampelopsis cantoniensis Planch. họ Nho (Vitaceae)”, nă 2002 [12].
Luận văn Thạc sỹ ược học của Trần Hư ng Giang v i đề tài “Nghiên cứu định tính và định lượng đồng thời Myricetin và Dihydromyricetin trong lá chè Dây
và trong chế phẩm ampelop bằng phương pháp HPLC” nă 2005.
Đề tài nghiên cứu do Phạm Thanh Kỳ làm chủ nhiệm: “Nghiên cứu quy trình sản xuất AMPELOP từ chè Dây (Ampelopsis cantoniensis Planch. Vitaeae) điều trị
loét dạ dày- hành tá tràng và tiếp tục đánh giá tác dụng lâm sàng của thuốc” nă
1998-2000 [11].
Cụ hoa ngù phân nhánh ọc đối iện v i á và ở đầu cành cuống cụ hoa nhẵn i 3 – 10 cm. Cuống cụ hoa thường dài 4-5 cm m i phân nhánh. Nụ úc non tròn sau gần h nh trứng. Hoa nhỏ u trắng ng . Cuống mỗi hoa 1-2 mm phủ nhiều lông; hợp ở gốc tạo th nh h nh chén 5 cánh hoa ép h i nhẵn; 5 nh ch nh ảnh ao phấn õ ở đầu trung đ i u nâu; c đĩa ật ép đĩa ật h i ; ầu h nh n n nhẵn 2 ô ỗi ô có 2 noãn.
Quả ọng h nh cầu úc non c u xanh úc chín c u đỏ, khi chín màu tí đ n, trên đ nh quả vẫn còn vết tích của vòi nhụ như ột cái gai nhỏ, đường kính 0,5 – 1 cm.
Mỗi quả chứa 2-3 hạt nhỏ hình trái xoan, mặt ngo i u nâu đ n 2 ép trắng trong, vỏ cứng như hạt chè.
Hình 1.1. Thân, lá, hoa của cây chè Dây (Nguồn: internet)
1.3. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN BỐ
Chi Song nho (Ampelopsis Mich.), họ Nho (Vitaceae), trên thế gi i có khoảng gần 30 loài. Ở Việt Nam có 5 o i trong đ 2 o i chè Dâ v chè Dây lá mỏng (Ampelopsis annamensis Gagnep.). Nh n h nh thái ên ngo i chúng tư ng đối giống nhau, nhất là về dạng lá và cách phát hoa. Để phân biệt được 2 loài này cần phải nghiên cứu về hình thái các bộ phận của hoa (Gagnep., 1912 và 1950; Nguyễn Thế Cường v Vũ Xuân Phư ng 2004). Đâ ột trở ngại trong việc nhận biết nhanh để phân biệt giữa 2 loài cùng chi này.
Trên thế gi i, chè Dây phân bố chủ yếu ở các nư c Châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Indonesia,...
Ở Việt Nam, cây chè Dây mọc hoang nhiều ở các t nh vùng núi phía Bắc và miền Trung Tây Nguyên như: Lạng S n (hu ện Tr ng Đ nh, Cao Lộc Văn Quan); Cao Bằng (Trùng Khánh, Quảng Hòa), Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát) H Giang (Đồng
hoà axit và làm liền vết oét thường người bệnh sẽ giả đau sau ch 8-9 ngày sử dụng. + Mát gan, an thần: Không giống các loại thuốc khác thường gây ảnh hưởng không tốt đến c chế đ o thải của gan cũng như các rối loạn về giấc ngủ. Hoạt chất flavonoid trong chè Dây có tác dụng mạnh trong việc giải độc gan cũng như an thần. Do vậy, có thể sử dụng lâu dài sản phẩm từ chè Dây và có thể sử dụng nó kết hợp v i các loại thuốc khác mà không gây tác dụng phụ, giúp bệnh nhân ăn ngủ tốt, ên tâ trong quá tr nh điều tr .
Trong giai đoạn điều tr : Chè có thế pha tha nư c uống dùng hàng ngày, nếu muốn tăng hiệu quả sử dụng nên dùng sản phẩm khoảng trư c 30 phút khi ăn để làm sạch dạ v đường ruột.
Công dụng của chè Dây và các sản phẩm bào chế từ chè Dây ở Việt Na ư c đầu được tóm tắt và thể hiện trên hình 1.15.
Hình 1.15. Dược tính tóm tắt của sản phẩm từ chè Dây [63]
Hiện trên thị trường có một số loại chế phẩm từ chè dây như
+ Chế phẩm dạng cao (HPMAX, AMPELOP): Được chiết xuất dạng cao đ ng viên con nhộng, tiện sử dụng nhưng o giá th nh cao nên kh sử dụng lâu dài.
CHƯƠNG 2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.1.NGUYÊN IỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT
2.1.1. Nguyên iệu
Thân lá cây chè Dây Ampelopsis Cantoniensis (Hook. & Arn.) K. Koch. được thu hái tại huyện Thông Nông (t nh Cao Bằng) và huyện Đông Giang (t nh Quảng Nam) vào tháng 5 nă 2016.
Hình 2.1. Thân lá chè Dây tươi được thu hái, phơi khô, cắt nhỏ và nghiền bột
Mẫu sau thu hái được rửa sạch để khô trong không khí, nghiền m n, bảo quản trong ao po t n v đựng trong hộp có nắp để n i râ át th o qu đ nh bảo quản bột ược liệu [1].
2.1.2.Thiết ị dụng cụ hóa ch t
. hiế ị ng c
Bình thủy tinh, tủ sấy, lò nung, cân phân tích, bếp cách thủy, sinh hàn hồi ưu cốc thủ tinh đũa thủy tinh, bình tam giác, ống đong ếp điện, phễu lọc, phễu chiết, các loại pip t nh đ nh mức, nhiệt kế, bình hút ẩm, bản mỏng, cột chạy sắc ký.
ình 2.3. Thiết bị cô quay chân không
- Má đo sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS 7890A/5975C của hãng Agilent.
ình 2.4. Thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ
. H ch
Các hóa chất mua về được sử dụng trực tiếp mà không qua tinh chế ha chưng cất lại.
Bảng 2.1. óa chất được sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hóa ch t Đ tinh khiết Tiêu
chuẩn Nguồn gốc
1 Hexane Tinh khiết TCCS Trung Quốc
2 Chloroform Tinh khiết TCCS Trung Quốc
3 Ethyl acetate Tinh khiết TCCS Trung Quốc
4 Dichloromethane Tinh khiết TCCS Trung Quốc
5 Ethanol 96o TCCS Việt Nam
6 Dung d ch HCl Tinh khiết TCCS Trung Quốc
7 Dung d ch HNO3 Tinh khiết TCCS Trung Quốc
8 Dung d ch CH3COOH Tinh khiết TCCS Trung Quốc
9 Silicagel Tinh khiết TCCS Merk
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGÂM DẦM TẠO TỔNG CAO ETHANO TỪ BỘT THÂN LÁ CHÈ DÂY
2.2.1. Nguyên tắc
Ngâm chất rắn (đã được nghiền nhỏ) vào dung môi thích hợp ở nhiệt độ và thời gian xác đ nh. Sau đ ọc lấy phần dung d ch rồi cô đuổi dung môi ở áp suất thấp. Có thể lặp lại vài lần để c ản lấy hết ượng chất có khả năng hòa tan trong ung ôi đ .
2.2.2. Cách tiến hành
Lấy 300 g bột thân á chè Dâ Đông Giang ngâ chiết bằng ethanol 96o ở nhiệt độ phòng, thời gian ngâm chiết 24 giờ, sử dụng máy khuấy (hoặc lắc đều sau mỗi 15 phút) để đảm bảo cho sự khuyếch tán tốt. Lọc gạn lấy phần d ch chiết rồi tiếp tục lọc qua giấy lọc trên phễu Buschle. Lặp lại 3 lần, lần đầu dùng 2 lít ethanol, những lần sau mỗi lần dùng 1 lít ethanol. Gộp các d ch chiết và cất loại thano ư i áp suất giảm ta được cao ethanol của thân lá chè Dây Đông Giang. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến h nh tư ng tự v i mẫu chè Dây Cao Bằng. Mẫu bột thân lá chè Dây Cao Bằng là 1500 g. Thể tích ethanol 96o dùng cho lần đầu là 10 lít, 2 lần sau mỗi lần dùng 5 lít.
Cân xác đ nh khối ượng cao thu được và tính % khối ượng cao chiết so v i khối ượng mẫu an đầu.
2.3. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHÂN BỐ ỎNG – ỎNG TỪ TỔNG CAO ETHANOL
2.3.1. Nguyên tắc
Nguyên tắc c bản của chiết lỏng-lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng hoàn toàn không hòa tan hay hòa tan rất ít vào nhau. Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của chất n đối v i hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng được biểu diễn bằng hằng số phân bố K:
K=Ca/Cb
Ca: nồng độ chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng. Cb: nồng độ chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng.
Lựa chọn dung môi chiết [10]:
Dung môi chiết phải đảm bảo các yêu cầu sau: - Dung môi chiết phải hòa tan tốt chất được chiết.
- Không hòa lẫn v i ung ôi cũ nghĩa c t khối khác nhiều v i ung ôi cũ. - Dung ôi n không được tư ng tác v i chất cần chiết và có nhiệt độ sôi tư ng đối thấp.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết - Ảnh hưởng của pH.
- Vai trò của sự tạo phức.
- Ảnh hưởng của sự tạo thành hợp chất ít tan.
2.3.2. Cách tiến hành
Lấy 10 g cao ethanol đ hòa tan lại bằng một ượng ethanol tối thiểu, tiếp th o cho nư c cất vào để được tổng thể tích 100 ml, lắc kỹ để cao phân tán đều trong nư c rồi chia thành 4 phần bằng nhau, cho vào 4 bình tam giác, mỗi bình là 250 . Sau đ tiến h nh chiết ỏng - ỏng v i các ung ôi h xan dichloromethane, chloroform, ethyl acetate. Chiết 3 lần, mỗi lần 100 ml dung môi. Thời gian lắc chiết mỗi lần là 1 giờ sau đ chuyển ngay lên phễu chiết loại 250 ml chờ tách l p và chiết riêng phần dung môi, làm khan bằng Na2SO4 rồi đ đ nh mức đến 100 ml, lấ 2 cho v o via để làm mẫu đo UV-Vis. Gộp d ch chiết của cả 3 cô đuổi ung ôi ư i áp suất giảm ta được các cao hexane, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate từ tổng cao ethanol. Cân xác đ nh khối ượng cao thu được và tính % khối ượng cao chiết so v i khối ượng của tổng cao ethanol.
Sau đ tiến h nh đ nh danh thành phần hóa học bằng phư ng pháp GC/MS.
2.4. PHÂN ẬP PHÂN ĐOẠN BẰNG SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ BẢN MỎNG
2.4.1. Sắc ký c t
Nạp ch t h p thu vào c t
Chuẩn b : Sử dụng cột sắc kí có kích thư c phù hợp v i ượng cao khảo sát. Lấy cốc 500 ml chứa sẵn dung môi hexane, cho từ từ silica gel (đã sấy ở 130oC
trong vòng 6 giờ) vào và khuấ đều đặn để đuổi hết bọt khí. Chú ý, không r t trực tiếp ung ôi v o chất hấp thu (si ica g ) ởi v chất hấp thu gặp ung ôi sẽ phát nhiệt c thể chất hấp thu v n cục không đồng nhất. Lượng ung ôi sử ụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt.
Ngâm hỗn hợp khoảng 12 giờ hoặc qua đê để silica g trư ng nở hết trong hexane. Trư c khi nhồi cột phải quan sát hỗn hợp hexane:silica gel, nếu hỗn hợp không có dạng sệt thì thêm hexane vào để hỗn hợp trở nên sệt như vậy khi nhồi cột hỗn hợp m i c thể r t chả xuống cột dễ ng. Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá. N i lỏng kẹp để có thể xoay cột theo vòng tròn, không n i kẹp rộng quá để tránh trường hợp cột không được giữ cố đ nh có khả năng r i vỡ. Cho mẫu bông nhỏ v o đá cột (để tránh silica gel lọt xuống bình hứng).
Cách tiến hành
Dùng ột phễu ọc c đuôi i đặt trên đầu cột cho vào cột 1 ượng hexane (có thể dùng hexane từ hỗn hợp hexane:silica g đã ngâm), dung môi hexane sẽ thấm qua bông gòn, giúp cố đ nh bông gòn ở ên ư i cột không b lệch khỏi đá cột trong lúc cho hỗn hợp hexane:silica gel vào. Mở nhẹ kh a ở ên ư i cột v dùng lọ thủy tinh hứng hexane chả ra ên ư i cột. Khi bông gòn đã được cố đ nh, ta vặn khóa lại và chú ý trong cột bây giờ vẫn còn dung d ch hexane cao khoảng 40 cm so v i chiều cao làm việc của cột. Đổ nhẹ từ từ hỗn hợp ở dạng sệt vào cột. Sau khi đổ 1 ít hỗn hợp vào cột, ta xoay nhẹ cột th o vòng tròn v ùng ột thanh cao su gõ nhẹ quanh th nh cột từ ư i ên trên để chất hấp thu nén đều trong cột v không b lỏng. Tiến hành mở nhẹ kh a ở ên ư i cột để ung ôi h xan tiếp tục chả ra từ từ v hứng v o ột ọ thủ tinh trống để ở ên ư i cột h xan sau khi hứng lại được r t v o đầu cột sắc ký. Tiếp tục đổ 1 ít hỗn hợp vào cột, tiến hành liên tục như vậ cho đến khi hết hỗn hợp để việc nạp cột được chặt chẽ cho thấ chất hấp thu trong cột c ạng đồng nhất.
Ta phải làm cho ặt thoáng chất hấp thu (si ica g ) ở đầu cột nằ ngang. Nếu ặt thoáng không nằ ngang phải cho ung ôi thê ên trên phần đầu cột ùng đũa thủ tinh khuấ đảo nhẹ phần ung ôi gần sát ặt thoáng xáo trộn ột
phần chất hấp thu ở trên đầu cột. Sau đ để ên chất hấp thu ắng xuống từ từ tạo nên ặt thoáng ằng phẳng. Để ổn đ nh cột qua đê nhằm tránh tình trạng nứt cột.
Nạp mẫu vào c t
Cao nghiên cứu được trộn v i một ượng silica gel vừa đủ rồi cô quay chân không đến khô hoàn toàn. Sau đ ấy ra, nghiền m n bằng cối chày sứ thu được mẫu cao đã thấ đều trên bề mặt silica gel. Cho mẫu cao này vào cột (đã nạp silica gel) qua một phễu nhỏ một cách từ từ để tránh tạo bọt khí và vón cục. Cột sắc ký sau khi nạp silica g được điều ch nh ượng dung môi hexane thích hợp (đủ thấ ư t mẫu khô cho vào). Phủ lên trên mẫu 1 l p silica gel mỏng nữa và cho 1 ít dung môi hexane ở trên đầu cột để cột ổn đ nh qua 3 giờ.
Chạy sắc ký c t silicagel
Rửa giải bằng hệ dung môi thích hợp dựa theo kết quả từ sắc ký bản mỏng. Tốc độ giải tha đổi tùy từng trường hợp cụ thể thông thường từ 0,5 – 1,5 ml/ phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Giải ly sử dụng ung ôi đ n nồng độ: ch sử dụng đ n ung ôi hoặc hỗn hợp ung ôi nhưng trong hỗn hợp t lệ giữa các thành phần không tha đổi để giải cho đến khi việc tách chất hoàn tất.
- Giải ly có nồng độ tăng ần: Đôi khi việc sử dụng một dung môi sẽ ch giải ly ra khỏi cột một số cấu tử nhất đ nh n o đ v ột số cấu tử khác có tính phân cực h n vẫn còn nằm ở đầu cột. Nếu muốn đuổi chúng ra khỏi cột, phải dùng một dung môi có lực mạnh h n. Trong quá trình sắc ký, cần tha đổi nhiều loại dung môi khác nhau, có lực mạnh tăng ần để có thể đuổi hết các cấu tử khác nhau ra khỏi cột. Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm; nếu tăng tính phân cực nhanh đột ngột sẽ làm gãy cột. Cột gãy làm mất đi sự liên tục của chất hấp thu và vì thế không tách chất tốt được.
- Th o õi quá tr nh giải : Hứng ung ch giải trong những ọ c đánh số thứ tự. Hứng ỗi ần thể tích như nhau 15 . Dung ch trong những ọ hứng được a h i còn ại khoảng 5 ml và chấm bản mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí bản mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn.
danh bằng GC/MS) để tiếp tục khảo sát. Các phân đoạn c ượng cao ít kết quả đ nh danh bằng GC/MS cho nhiều tạp chất rất kh khảo sát tiếp v nếu c cô ập được chất tinh khiết sẽ không đủ ượng ẫu để khảo sát cấu trúc h a học ằng phư ng pháp h a hiện đại.
2.4.2. Sắc ký ản mỏng
Phư ng pháp n được Iz ai op v Schr i r đề ngh từ nă 1938 được Stan phát triển ho n thiện nă 1955 v c ứng ụng rộng rãi.
Phư ng pháp sắc ký l p mỏng được ùng để đ nh tính, thử độ tinh khiết v đôi khi để án đ nh ượng hoặc đ nh ượng hoạt chất thuốc. Sắc ký l p mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đ đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng