6. Bố cục uận văn
2.2.2. Cách tiến hành
Lấy 300 g bột thân á chè Dâ Đông Giang ngâ chiết bằng ethanol 96o ở nhiệt độ phòng, thời gian ngâm chiết 24 giờ, sử dụng máy khuấy (hoặc lắc đều sau mỗi 15 phút) để đảm bảo cho sự khuyếch tán tốt. Lọc gạn lấy phần d ch chiết rồi tiếp tục lọc qua giấy lọc trên phễu Buschle. Lặp lại 3 lần, lần đầu dùng 2 lít ethanol, những lần sau mỗi lần dùng 1 lít ethanol. Gộp các d ch chiết và cất loại thano ư i áp suất giảm ta được cao ethanol của thân lá chè Dây Đông Giang.
Tiến h nh tư ng tự v i mẫu chè Dây Cao Bằng. Mẫu bột thân lá chè Dây Cao Bằng là 1500 g. Thể tích ethanol 96o dùng cho lần đầu là 10 lít, 2 lần sau mỗi lần dùng 5 lít.
Cân xác đ nh khối ượng cao thu được và tính % khối ượng cao chiết so v i khối ượng mẫu an đầu.
2.3. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHÂN BỐ ỎNG – ỎNG TỪ TỔNG CAO ETHANOL
2.3.1. Nguyên tắc
Nguyên tắc c bản của chiết lỏng-lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng hoàn toàn không hòa tan hay hòa tan rất ít vào nhau. Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của chất n đối v i hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng được biểu diễn bằng hằng số phân bố K:
K=Ca/Cb
Ca: nồng độ chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng. Cb: nồng độ chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng.
Lựa chọn dung môi chiết [10]:
Dung môi chiết phải đảm bảo các yêu cầu sau: - Dung môi chiết phải hòa tan tốt chất được chiết.
- Không hòa lẫn v i ung ôi cũ nghĩa c t khối khác nhiều v i ung ôi cũ. - Dung ôi n không được tư ng tác v i chất cần chiết và có nhiệt độ sôi tư ng đối thấp.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết - Ảnh hưởng của pH.
- Vai trò của sự tạo phức.
- Ảnh hưởng của sự tạo thành hợp chất ít tan.
2.3.2. Cách tiến hành
Lấy 10 g cao ethanol đ hòa tan lại bằng một ượng ethanol tối thiểu, tiếp th o cho nư c cất vào để được tổng thể tích 100 ml, lắc kỹ để cao phân tán đều trong nư c rồi chia thành 4 phần bằng nhau, cho vào 4 bình tam giác, mỗi bình là 250 . Sau đ tiến h nh chiết ỏng - ỏng v i các ung ôi h xan dichloromethane, chloroform, ethyl acetate. Chiết 3 lần, mỗi lần 100 ml dung môi. Thời gian lắc chiết mỗi lần là 1 giờ sau đ chuyển ngay lên phễu chiết loại 250 ml chờ tách l p và chiết riêng phần dung môi, làm khan bằng Na2SO4 rồi đ đ nh mức đến 100 ml, lấ 2 cho v o via để làm mẫu đo UV-Vis. Gộp d ch chiết của cả 3 cô đuổi ung ôi ư i áp suất giảm ta được các cao hexane, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate từ tổng cao ethanol. Cân xác đ nh khối ượng cao thu được và tính % khối ượng cao chiết so v i khối ượng của tổng cao ethanol.
Sau đ tiến h nh đ nh danh thành phần hóa học bằng phư ng pháp GC/MS.
2.4. PHÂN ẬP PHÂN ĐOẠN BẰNG SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ BẢN MỎNG
2.4.1. Sắc ký c t
Nạp ch t h p thu vào c t
Chuẩn b : Sử dụng cột sắc kí có kích thư c phù hợp v i ượng cao khảo sát. Lấy cốc 500 ml chứa sẵn dung môi hexane, cho từ từ silica gel (đã sấy ở 130oC
trong vòng 6 giờ) vào và khuấ đều đặn để đuổi hết bọt khí. Chú ý, không r t trực tiếp ung ôi v o chất hấp thu (si ica g ) ởi v chất hấp thu gặp ung ôi sẽ phát nhiệt c thể chất hấp thu v n cục không đồng nhất. Lượng ung ôi sử ụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt.
Ngâm hỗn hợp khoảng 12 giờ hoặc qua đê để silica g trư ng nở hết trong hexane. Trư c khi nhồi cột phải quan sát hỗn hợp hexane:silica gel, nếu hỗn hợp không có dạng sệt thì thêm hexane vào để hỗn hợp trở nên sệt như vậy khi nhồi cột hỗn hợp m i c thể r t chả xuống cột dễ ng. Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá. N i lỏng kẹp để có thể xoay cột theo vòng tròn, không n i kẹp rộng quá để tránh trường hợp cột không được giữ cố đ nh có khả năng r i vỡ. Cho mẫu bông nhỏ v o đá cột (để tránh silica gel lọt xuống bình hứng).
Cách tiến hành
Dùng ột phễu ọc c đuôi i đặt trên đầu cột cho vào cột 1 ượng hexane (có thể dùng hexane từ hỗn hợp hexane:silica g đã ngâm), dung môi hexane sẽ thấm qua bông gòn, giúp cố đ nh bông gòn ở ên ư i cột không b lệch khỏi đá cột trong lúc cho hỗn hợp hexane:silica gel vào. Mở nhẹ kh a ở ên ư i cột v dùng lọ thủy tinh hứng hexane chả ra ên ư i cột. Khi bông gòn đã được cố đ nh, ta vặn khóa lại và chú ý trong cột bây giờ vẫn còn dung d ch hexane cao khoảng 40 cm so v i chiều cao làm việc của cột. Đổ nhẹ từ từ hỗn hợp ở dạng sệt vào cột. Sau khi đổ 1 ít hỗn hợp vào cột, ta xoay nhẹ cột th o vòng tròn v ùng ột thanh cao su gõ nhẹ quanh th nh cột từ ư i ên trên để chất hấp thu nén đều trong cột v không b lỏng. Tiến hành mở nhẹ kh a ở ên ư i cột để ung ôi h xan tiếp tục chả ra từ từ v hứng v o ột ọ thủ tinh trống để ở ên ư i cột h xan sau khi hứng lại được r t v o đầu cột sắc ký. Tiếp tục đổ 1 ít hỗn hợp vào cột, tiến hành liên tục như vậ cho đến khi hết hỗn hợp để việc nạp cột được chặt chẽ cho thấ chất hấp thu trong cột c ạng đồng nhất.
Ta phải làm cho ặt thoáng chất hấp thu (si ica g ) ở đầu cột nằ ngang. Nếu ặt thoáng không nằ ngang phải cho ung ôi thê ên trên phần đầu cột ùng đũa thủ tinh khuấ đảo nhẹ phần ung ôi gần sát ặt thoáng xáo trộn ột
phần chất hấp thu ở trên đầu cột. Sau đ để ên chất hấp thu ắng xuống từ từ tạo nên ặt thoáng ằng phẳng. Để ổn đ nh cột qua đê nhằm tránh tình trạng nứt cột.
Nạp mẫu vào c t
Cao nghiên cứu được trộn v i một ượng silica gel vừa đủ rồi cô quay chân không đến khô hoàn toàn. Sau đ ấy ra, nghiền m n bằng cối chày sứ thu được mẫu cao đã thấ đều trên bề mặt silica gel. Cho mẫu cao này vào cột (đã nạp silica gel) qua một phễu nhỏ một cách từ từ để tránh tạo bọt khí và vón cục. Cột sắc ký sau khi nạp silica g được điều ch nh ượng dung môi hexane thích hợp (đủ thấ ư t mẫu khô cho vào). Phủ lên trên mẫu 1 l p silica gel mỏng nữa và cho 1 ít dung môi hexane ở trên đầu cột để cột ổn đ nh qua 3 giờ.
Chạy sắc ký c t silicagel
Rửa giải bằng hệ dung môi thích hợp dựa theo kết quả từ sắc ký bản mỏng. Tốc độ giải tha đổi tùy từng trường hợp cụ thể thông thường từ 0,5 – 1,5 ml/ phút.
- Giải ly sử dụng ung ôi đ n nồng độ: ch sử dụng đ n ung ôi hoặc hỗn hợp ung ôi nhưng trong hỗn hợp t lệ giữa các thành phần không tha đổi để giải cho đến khi việc tách chất hoàn tất.
- Giải ly có nồng độ tăng ần: Đôi khi việc sử dụng một dung môi sẽ ch giải ly ra khỏi cột một số cấu tử nhất đ nh n o đ v ột số cấu tử khác có tính phân cực h n vẫn còn nằm ở đầu cột. Nếu muốn đuổi chúng ra khỏi cột, phải dùng một dung môi có lực mạnh h n. Trong quá trình sắc ký, cần tha đổi nhiều loại dung môi khác nhau, có lực mạnh tăng ần để có thể đuổi hết các cấu tử khác nhau ra khỏi cột. Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm; nếu tăng tính phân cực nhanh đột ngột sẽ làm gãy cột. Cột gãy làm mất đi sự liên tục của chất hấp thu và vì thế không tách chất tốt được.
- Th o õi quá tr nh giải : Hứng ung ch giải trong những ọ c đánh số thứ tự. Hứng ỗi ần thể tích như nhau 15 . Dung ch trong những ọ hứng được a h i còn ại khoảng 5 ml và chấm bản mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí bản mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn.
danh bằng GC/MS) để tiếp tục khảo sát. Các phân đoạn c ượng cao ít kết quả đ nh danh bằng GC/MS cho nhiều tạp chất rất kh khảo sát tiếp v nếu c cô ập được chất tinh khiết sẽ không đủ ượng ẫu để khảo sát cấu trúc h a học ằng phư ng pháp h a hiện đại.
2.4.2. Sắc ký ản mỏng
Phư ng pháp n được Iz ai op v Schr i r đề ngh từ nă 1938 được Stan phát triển ho n thiện nă 1955 v c ứng ụng rộng rãi.
Phư ng pháp sắc ký l p mỏng được ùng để đ nh tính, thử độ tinh khiết v đôi khi để án đ nh ượng hoặc đ nh ượng hoạt chất thuốc. Sắc ký l p mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đ đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích được trải thành l p mỏng đồng nhất v được cố đ nh trên các phiến kính hoặc phiến ki oại. Pha động ột hệ ung ôi đ n hoặc đa th nh phần được trộn v i nhau th o tỷ ệ qu đ nh trong từng chu ên uận. Trong quá tr nh i chu ển qua p hấp phụ các cấu tử trong hỗn hợp ẫu thử được i chu ển trên p ỏng th o hư ng pha động v i những tốc độ khác nhau. Kết quả ta thu được ột sắc k đồ trên p ỏng. C chế của sự chia tách c thể c chế hấp phụ phân ố trao đổi ion s ng ọc phân tử ha sự phối hợp đồng thời của nhiều c chế tù thuộc v o tính chất của chất pha tĩnh v ung ôi pha động.
Ðại ượng đặc trưng cho ức độ i chu ển của chất phân tích hệ số i chu ển Rf được tính ằng tỷ ệ giữa khoảng ch chu ển của chất thử v khoảng ch chu ển của ung ôi: Rf = a/ b
Trong đ :
a - L khoảng cách từ điể xuất phát đến tâ của vết ẫu.
b - L khoảng cách từ điể xuất phát đến ức ung ôi đo trên cùng đường đi của vết tính ằng c .
Rf: Ch có giá tr từ 0 đến 1.
Ưu điểm của kỹ thuật: Hiệu quả tách cao thời gian ngắn ượng chất ít thường được ùng để đ nh tính v tách các hợp chất thiên nhiên. N cũng được các nh h a
học tổng hợp sử ụng thường xu ên để nhanh ch ng phân tách các chất thu được trong phản ứng.
Nhược điểm của kỹ thuật: Th nh phần pha động ễ tha đổi trong quá tr nh khai triển các vết sau khai triển thường kéo đuôi v ch ùng khi hỗn hợp cần tách c số ượng ít v i tră i iga còn nếu ẫu nhiều v i ga th tách ằng sắc k cột sẽ kinh tế h n [10]. Chuẩn bị dụng cụ và thuốc thử Dụng cụ + Ðèn tử ngoại. + Máy ảnh. + Máy sấy. + Bản mỏng tráng si icag c kích thư c 5 x 10 c . Hình 2.5. Hộp bản mỏng có ích thư c 5 x 10 cm
+ Bình triển khai bằng thủy tinh trong suốt, có nắp đậy kín.
+ Micropipet nhiều cỡ từ 1 đến 20 ml, và các ống mao quản. + Cột sắc ký (d = 3,5 cm, h = 50 cm).
+ Cột sắc ký (d = 1,5 cm, h = 45 cm). + Cột sắc ký (d = 1 cm, h = 45 cm). + Các lọ thủy tinh (15 ml).
Công thức pha dung dịch thuốc thử hiện màu dung dịch vani in 1 trong axit sunfuric)
Cho vào cốc loại 500 ml hỗn hợp gồm 200 ml CH3OH và 25 ml CH3COOH đậ đặc, khuấ đều sau đ cho từ từ 11 ml H2SO4 đậ đặc vào. Tiếp theo cho 1,2 g vanillin vào hỗn hợp trên, khuấ đều tay. Dung d ch sau khi khuấ được cho vào bình thủy tinh màu tối đậy nút kín.
Chuẩn ị nh tri n khai
B nh triển khai dạng h nh khối trụ hoặc khối chữ nhật c đường kính n h n ề ngang ản ỏng. Đặt ột tờ giấ ọc ao phủ ặt trong của nh nhưng vẫn chừa ột khoảng để c thể quan sát ên trong. Dùng một mặt kính đồng hồ đậy kín bình triển khai để dung môi không b a h i trong quá tr nh giải ly.
Chuẩn bị bản mỏng chạy sắc ký
Cắt ản ỏng ra th nh những ản nhỏ c kích thư c 1 x 10 c . Dùng út ch ũi nhọn vạch ức xuất phát cách ép ư i ản ỏng 1 c ức tiền tu ến ung môi cách ép trên ản ỏng 0 5 cm.
Lựa chọn dung m i giải ly
Chọn ung ôi triển khai tù thuộc v o ẫu cần tách. V i ẫu chưa iết th nh phần chưa c t i iệu tha khảo cần thử nghiệ v i nhiều oại ung ôi khác nhau từ không phân cực đến phân cực.
Ch m ản mỏng và sử dụng bình tri n khai
Cho ung ôi giải v o nh sao cho p ung ôi khoảng 0,5 – 0,7 c để ên 5-10 phút để ão hòa h i ung ôi trong nh (nhờ tờ giấ ọc).
Dùng vi ao quản nhúng nhẹ phần đầu nhọn v o ch được chuẩn b từ cao h xan ực ao ẫn sẽ hút ung ch v o vi quản chấ nhẹ phần đầu nhọn chứa
dung d ch ên trên ản ỏng tại ột điể cách ản 1 c (điể n phải ở v trí sao cho khi nhúng ản ỏng v o nh triển khai th điể chấ n vẫn nằ trên cao khỏi ặt thoáng của ung ch giải chứa trong nh).
Lưu ý: Chạ nhẹ vi quản v o ề ặt ản ỏng để không nh n thấ ỗ trên ề ặt v ch tạo th nh ột điể tròn nhỏ (v nếu chạ âu điể n sẽ an to). Thổi nhẹ ên vết chấ để ung ôi a h i nhanh không an th nh vết chấ to. C thể chấ thê ên nga vết chấ cũ v i ần nữa để c vết đậ rõ đường kính không quá 2 . Nếu cần chấ cùng nhiều vết chấ ên ột ản th các vết chấ phải cách đá ản 1 c cách đều nhau 1 c v cách hai cạnh ên 1 c .
Khi cho bản mỏng vào bình triển khai thì phải cầ thẳng đứng ản mỏng rồi m i nhúng v o ung ôi trong nh. Khi nhúng v o phải cẩn thận để 2 cạnh ên của ản không chạ v o th nh nh úc đ v trí của các vết chấ ẫu nằ trên cao cách ặt thoáng của ung ôi khoảng 0 5 cm.
Đậ nắp nh triển khai ung ôi sẽ được hút ên ản ởi ực hút ao ẫn. Th o õi khi ực ung ôi ên đến vạch tiền tu ến ung ôi đã được vạch sẵn trư c đ (cách đầu ản 0 5 c ) th ấ ản ra khỏi nh sấ khô ản ằng á sấ .
Cách hiện h nh vết sắc ký đ ác định Rf
Tiến h nh việc hiện h nh vết sắc k ằng phư ng pháp h a học hoặc vật . Quan sát trong uồng soi UV ư i ánh sáng tử ngoại ư c s ng 254 nm và 366 nm hoặc nhúng, phun x t ung ch thuốc thử hiện u c thể tác ụng v i các cấu tử của hỗn hợp th nh hỗn hợp u nh n rõ ằng ắt thường v sấ khô ằng máy sấ trong 4-5 phút.
Nhận xét về u sắc, từ giá tr Rf của các vết thu được chọn hệ ung ôi khai triển hệ ung ôi cho các vết tách riêng iệt rõ r ng.
2.5. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌCBẰNG PHƯƠNG PHÁP GC/MS
2.5.1. Nguyên tắc
Nhờ c khí ang c trong khí ẫu từ buồng h i được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc k được diễn ra tại đâ . Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần ượt đi v o t ctor tại đ
chúng được chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu n được khuếch đại rồi chuyển