Bước 1. Chuẩn bị mẫu:
-Cân 2,0 g mẫu lá, chuyển vào ống Eppendorf 2ml mới
-Bổ sung 2 viên bi và 1200 µl dung dịch extraction buffer chuyển vào máy đồng hoá mẫu. Tiến hành đồng hoá mẫu với 3 chu kỳ, mỗi chu kỳ 4000 vòng/phút trong 30 giây để thu dịch nổi đồng nhất
-Ly tâm mẫu với tốc độ 10.000 vòng/ phút trong 10 phút, ở nhiệt độ 10°C -Sử dụng micropipet hút chuyển phần dịch nổi sang ống Eppendorf 1,5 ml mới
Lưu ý: Chỉ chuẩn bị mẫu ngay trước khi tiến hành thực hiện phản ứng ELISA, không chuẩn bị mẫu trước quá 1 ngày.
Bước 2: Chuẩn bị kháng thể bắt giữ đặc hiệu
- Pha loãng kháng thể bắt giữ (Capture antibody) của hãng Agritest (Ý) trong dung dịch đệm Coating buffer theo tỷ lệ 1:500 (v/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Bổ sung 200µl kháng thể bắt giữ đặc hiệu đã được pha loãng vào mỗi giếng.
- Ủ ở 37oC trong 2h. Để cố định kháng thể vào giếng
- Rửa khay 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet hút toàn bộ dung dịch trong các giếng.
Bước3: Bổ sung mẫu phân tích
- Chuẩn bị mẫu phân tích thu được như ở trên và mẫu kiểm chứng của hãng Agritest (Ý).
- Bổ sung 200µl/giếng dung dịch mẫu phân tích. - Ủ 2h - 4h ở 37oC.
- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.
Bước 4: Bổ sung kháng thể cộng hợp enzyme
- Pha loãng kháng thể cộng hợp enzyme (Conjugate antibody) của hãng Agritest (Ý) trong dung dịch đệm Conjugate buffer theo tỷ lệ 1:500 (v/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Bổ sung 200µl/giếng dung dịch chứa kháng thể cộng hợp. - Ủ 2h ở 37oC hoặc qua đêm ở 4 oC.
- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.
- Pha loãng cơ chất p-nitrophenil phosphate (Merck) trong dung dịch đệm Substrate buffer theo tỷ lệ 1/10 (m/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Bổ sung 200µl cơ chất vào giếng.
- Ủ ở nhiệt độ phòng đến khi phát ra tín hiệu nhận biết có thể quan sát bằng mắt thường (khoảng 1-3h).
Bước 6: Kiểm tra kết quả
Quan sát tín hiệu màu phát ra ở các giếng bằng mắt thường, so sánh với kết của các mẫu đối chứng dương tính, âm tính. Có thể ngưng phát tín hiệu bằng cách thêm vào mỗi giếng 50µl Natri hydroxit 3M.