Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép
Trong các kỹ thuật ghép, để cây ghép sinh trưởng phát triển tốt cần phải lựa chọn gốc ghép phù hợp. Các loại gốc ghép thường sử dụng là những loài cây dại, khỏe mạnh, chống chịu tốt, thích nghi với điều kiện môi trường và có quan hệ gần gũi về mặt di truyền với cây ghép. Trong nghiên cứu này, để tiến hành vi ghép cải tiến cam Bố Hạ, các loại gốc ghép là cam, chấp, bưởi diễn được lựa chọn để thử nghiệm. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép cải tiến được tổng hợp trong bảng 4.1 dưới đây:
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép cải tiến (sau 30 ngày vi ghép) Công thức Loại gốc ghép Số lượng gốc ghép Số lượng cây sống (tỷ lệ %) Số lượng cây chết (tỷ lệ %) CT1 Gốc cam Hàm Yên 30 0 100 CT2 Gốc chấp 30 16,6 83,3 CT3 Gốc bưởi Diễn 30 100 0
Dựa trên bảng 4.1 cho thấy: Sử dụng các loại gốc ghép khác nhau cho tỷ lệ cây vi ghép sống khác nhau rõ rệt. Trong đó, nếu sử dụng cam Hàm Yên làm gốc ghép, 100% số cây vi ghép bị chết. Gốc ghép là bưởi Diễn, 100% số cây vi ghép sống sau 30 ngày theo dõi. Trong khi đó, sử dụng chấp làm gốc ghép, số cây vi ghép sống là 5/30 cây, chiếm tỷ lệ 16,6%.
Hơn nữa, chấp và cam Hàm Yên là những loài có hạt đa phôi, 100% số hạt bưởi Diễn là hạt đơn phối. Vì vậy, để tạo cây gốc ghép, trong nghiên cứu chỉ sử dụng những hạt đơn phôi để gieo tạo cây gốc ghép. Các thử nghiệm khi sử dụng hạt đa phôi làm gốc ghép, cây gốc ghép sinh trưởng yếu, nhỏ không đủ điều kiện để ghép.
Sau khi gieo 3 tuần, gốc ghép đạt kích thước về chiều cao ở cam Hàm Yên, chấp và bưởi Diễn lần lượt là 2,8 cm, 3,5 cm và 5,0 cm tiến hành vi ghép cải tiến. Kết quả này cũng cho thấy, sử dụng bưởi Diễn làm gốc ghép, cây gốc ghép sinh trưởng tốt hơn, kích thước lớn hơn, dễ ghép hơn. Cây vi ghép sinh trưởng tốt hơn.
Từ những kết quả thu được ở trên chúng tôi khẳng định rằng sử dụng bưởi Diễn làm gốc ghép phù hợp để vi ghép cải tiến cam Bố Hạ. Do vậy, trong các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sử dụng bưởi Diễn làm gốc ghép.
Hình 4.1. Hình ảnh 3 loại gốc ghép sau 25 ngày gieo hạt và 1 tuần vi ghép
A. Gốc bưởi Diễn; B. Gốc chấp; C. Gốc cam Hàm Yên D. Mầm ghép trên gốc bưởi; E. Mầm ghép trên gốc chấp
F. Mầm ghép trên gốc cam
4.2. Kết quả theo dõi ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm của hạt bưởi Diễn
Điều kiện chiếu sáng có thể ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt. Một số loại hạt trong môi trường rừng tự nhiên sẽ không nảy mầm cho đến khi có lượng ánh sáng vừa đủ [17]. Trong nghiên cứu này, để tìm hiểu ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến sự nảy mầm của hạt cây gốc ghép, chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo 3 công thức với các thời gian chiếu sáng/ngày khác nhau, gồm: CT1 6 h/ngày, CT2 12 h/ngày và CT3 24 h/ngày. Dưới đây là kết quả nghiên cứu của 3 công thức trên sau 3 tuần gieo hạt.
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến tốc độ nảy mầm của hạt bưởi Diễn (sau 3 tuần gieo hạt)
Công thức Số lượng hạt Thời gian chiếu sáng (giờ/ngày) Số lượng cây sống (tỷ lệ %) Số lượng cây chết (tỷ lệ %) Chất lượng cây gốc ghép CT1 30 6 100 0 Mầm mập, xanh thẫm CT2 30 12 100 0 Bình thường, xanh thẫm CT3 30 24 100 0 Mầm nhỏ, xanh thẫm
Dựa trên kết quả của bảng 4.2 cho thấy, tỷ lệ nảy mầm các hạt là 100% ở tất cả các công thức, điều đó chứng tỏ ánh sáng không ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm của hạt bưởi Diễn. Tuy nhiên, sau 30 ngày theo dõi, so sánh về hình thái của mầm cho thấy, các hạt được chiếu sáng với thời gian khác nhau có hình thái khác nhau. Các hạt được chiếu sáng 6 h/ngày có mầm mập, màu xanh thẫm, các hạt được chiếu sáng 12 h/ngày (Công thức 2) có mầm bình thường còn các hạt được chiếu sáng 24 h/ngày mầm nhỏ.
Như vậy, hạt được chiếu sáng 6 h/ngày cho chất lượng mầm tốt nhất, tỷ lệ nảy mầm là 100%. Do đó, chúng tôi chọn thời gian chiếu sáng là 6 h/ngày trong 3 tuần để tạo cây bưởi Diễn làm gốc ghép.
Hình 4.2. Hình ảnh hạt bưởi sau 3 tuần gieo hạt
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi gốc ghép đến hiệu quả vi ghép
Tuổi gốc ghép là một trong những tiêu chí quan trọng trong việc chọn thời điểm phù hợp tiến hành vi ghép để đạt được hiệu quả cao và cây vi ghép phát triển tốt. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn gốc ghép là bưởi Diễn, tiến hành vi ghép cải tiến khi gốc ghép được 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần và 4 tuần tuổi. Kết quả thể hiện trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của tuổi gốc ghép bưởi Diễn đến hiệu quả vi ghép cam Bố Hạ (sau 30 ngày vi ghép)
Công thức Độ tuổi gốc ghép Số lượng gốc ghép Số lượng cây sống ( tỷ lệ %) Số lượng cây chết (tỷ lệ %) CT1 1 tuần 30 0 100 CT2 2 tuần 30 83,33 16,66 CT3 3 tuần 30 100 0 CT4 4 tuần 30 90,0 10,0
Kết quả thể hiện trong bảng 4.3 cho thấy: Tuổi của gốc ghép khác nhau cho tỷ lệ cây sống sau vi ghép khác nhau. Cụ thể, sử dụng gốc ghép 1 tuần tuổi, 100% mầm ghép bị chết. Tỷ lệ cây vi ghép sống tăng dần khi tuổi của mầm ghép tăng từ 2 tuần đến 3 tuân sau đó giảm xuống khi sử dụng gốc ghép 4 tuần tuổi. Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở công thức 3, sử dụng gốc ghép là bưởi Diễn 3 tuần tuổi, tỷ lệ mầm ghép sống, sinh trưởng cao nhất, đạt 100%.
Trong quá trình theo dõi nghiên cứu chúng tôi cũng nhận thấy, gốc ghép ở giai đoạn 1 tuần tuổi rất non, yếu, khó ghép, mầm ghép bị chết. Khi sử dụng gốc ghép 2 tuần tuổi, gốc ghép mặc dù cứng hơn nhưng vẫn rất dễ bị gãy, khó tiến hành ghép. Khi sử dụng gốc ghép 4 tuần tuổi, phần thân của gốc ghép cứng, khó thao tác mặc dù tỷ lệ mầm ghép sống cao (đạt 90%). Cây gốc ghép 3 tuần tuổi có kích thước và độ cứng của thân phù hợp cho việc ghép mầm cam Bố Hạ, tỷ lệ sống của cây vi ghép cũng cao nhất (100% cây vi ghép sống, sinh trưởng).
Từ kết quả nghiên cứu trên có thể rút ra kết luận là sử dụng gốc ghép là bưởi Diễn 3 tuần tuổi phù hợp nhất để vi ghép cải tiến cam Bố Hạ. Do đó, trong các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi sử dụng gốc ghép là bưởi diễn 3 tuần tuổi.
Hình 4.3. Hình ảnh cây vi ghép sử dụng các gốc ghép với độ tuổi khác nhau (sau 30 ngày thao dõi)
A. Công thức 1; B. Công thức 2; C. Công thức 3; D. Công thức 4
4.4. Kết quả ảnh hưởng của tuổi mầm ghép đến hiệu quả vi ghép
Tuổi của mầm ghép cũng là yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sống, sinh trưởng của cây vi ghép. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn vật liệu ghép là mầm cam Bố Hạ có độ tuổi từ 1 tuần đến 4 tuần. Tiến hành ghép trên gốc ghép là bưởi Diễn 3 tuần tuổi. Theo dõi tỷ lệ cây sống và cây chết sau vi ghép 30 ngày. Kết quả được tổng hợp trong bảng 4.4 như sau:
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của tuổi mầm ghép đến hiệu quả vi ghép (sau 30 ngày vi ghép) Công thức Độ tuổi mầm Số lượng mẫu Số lượng cây sống (tỷ lệ %) Số lượng cây chết (tỷ lệ %) CT1 1 tuần tuổi 30 0 100 CT2 2 tuần tuổi 30 0 100 CT3 3 tuần tuổi 30 100 0 CT4 4 tuần tuổi 30 20 80
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi sử dụng mầm ghép cam Bố Hạ ở 1 tuần đến 2 tuần (công thức 1 và công thức 2), 100% số cây vi ghép bị chết sau 30 ngày theo dõi. Sử dụng mầm ghép 3 tuần tuổi (từ 21- 24 ngày tuổi), tất cả cây vi ghép đều sống, vết ghép liền sẹo với gốc ghép, cây sinh trưởng tốt, không nhiễm nấm bệnh, không biểu hiện bệnh greening, tristeza.
Tuy nhiên, khi sử dụng vật liệu là mầm cam Bố Hạ 4 tuần tuổi (công thức 4), tỷ lệ cây sống và sinh trưởng giảm mạnh (chỉ đạt 20% số cây sống, tương đương với 6 cây trong tổng số 30 cây nghiên cứu). Cây sinh trưởng chậm hơn so với công thức 3, vết ghép lâu liền sẹo.
Như vậy, sử dụng mắt ghép cam Bố Hạ từ 21 – 24 ngày tuổi tính từ lúc mầm bắt đầu bật phù hợp nhất để tiến hành vi ghép cải tiến trên gốc ghép là bưởi Diễn.
Hình 4.4. Hình ảnh cây vi ghép sử dụng mầm ghép ở các độ tuổi khác nhau (sau 30 ngày theo dõi)
A. Công thức 1; B. Công thức 2; C. Công thức 3; D. Công thức 4
4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kỹ thuật ghép đến hiệu quả vi ghép
Các kỹ thuật ghép quyết định sự sống và phát triển của cây vi ghép vì vậy chúng đã tiến hành nghiên cứu với 3 kỹ thuật ghép để tìm ra kỹ thuật ghép tốt nhất cho quá trình vi ghép cải tiến. Dưới đây là kết quả nghiên cứu các kỹ thuật ghép trong vi ghép cải tiến
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của kỹ thuật ghép đến hiệu quả vi ghép (sau 30 ngày vi ghép) Công thức Số lượng cây ghép Các kỹ thuật ghép Số lượng cây sống ( tỷ lệ %) Số lượng cây chết (tỷ lệ %) CT1 30 Ghép bằng 0 100 CT2 30 Ghép áp 0 100 CT3 30 Ghép hình chữ V 100 0
Kết quả nghiên cứu trong bảng 4.5 cho thấy, khi sử dụng kỹ thuật ghép bằng và ghép áp, mầm ghép không gắn được với gốc ghép, toàn bộ mầm ghép bị chết ngay sau khi ghép. Tuy nhiên, với kỹ thuật ghép hình chữ V, mắt ghép dễ dàng cố định trên gốc ghép và liền sẹo với gốc ghép. 100% mầm ghép sống và sinh trưởng sau 30 ngày vi ghép (công thức 3). Như vậy kỹ thuật ghép hình chữ V phù hợp nhất cho quá trình vi ghép cải tiến cam Bố Hạ trên gốc bưởi Diễn.
Hình 4.5. Hình ảnh cây vi ghép bằng các kỹ thuật sau 1 tuần ghép
A. Công thức 1; B. Công thức 2; C. Công thức 3
4.6. Kết quảnghiên cứuảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng hiệu quả vi ghép
Bên cạnh nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến tỷ lệ nảy mầm của hạt cây gốc ghép, chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng với cường độ khác nhau đến khả năng sống của mầm cam Bố Hạ sau vi ghép. Kết quả được thể hiện trong bảng 4.6 dưới đây:
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng hiệu quả vi ghép (sau 30 ngày vi ghép) Công thức Số lượng cây ghép Điều kiện chiếu sáng Số lượng cây sống (tỷ lệ %) Số lượng cây chết (tỷ lệ %) Đặc điểm cây vi ghép CT1 30 Không có ánh sáng 100 0 liền sẹo nhanh, thời gian bật chồi chậm CT2 30 Ánh sáng yếu 100 0 Liền sẹo chậm, thời gian bật chồi nhanh CT3 30 Ánh sáng trực xạ 0 100 - CT4 30 1 tuần không có ánh sáng + 3 tuần ánh sáng yếu 100 0 Liền sẹo nhanh, thời gian bật chồi nhanh
Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau khi ghép, cây được đặt trong điều kiện
không có ánh sáng hoặc trong điều kiện ánh sáng yếu (2.000 – 2.500 lux), tỷ lệ cây vi ghép sống là 100% sau 30 ngày theo dõi. Tuy nhiên, cây được không được chiếu sáng có thời gian liền sẹo với gốc ghép nhanh hơn nhưng thời gian bật chồi chậm hơn so với khi cây được đặt ở điều kiện ánh sáng yếu.
Đối với cây vi ghép ở công thức 4, sau vi ghép cây được đặt trong bóng tối 1 tuần rồi đưa ra điều kiện chiếu sáng yếu, thời gian liền sẹo và thời gian bật chồi nhanh nhất, tỷ lệ cây sống là 100%.
Hình 4.6. Hình ảnh cây vi ghép để trong các điều kiện chiếu sáng (sau 3 tuần ghép)
A. Công thức 1; B. Công thức 2; C. Công thức 3; D. Công thức 4
4.7. Kết quả kiểm tra bệnh greening và bệnh tristeza bằng chỉ thị phân tử
Bệnh greening và bệnh tristeza là 2 bệnh phổ biến, gây thiệt hại nặng nề cho nghề trồng cam. Vì vậy, trong sản xuất cần thiết phải tạo được cây sạch bệnh về 2 loại bệnh này. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tạo được 18 cây cam Bố Hạ bằng kỹ thuật vi ghép cải tiến từ nguồn vật liệu ban đầu là cây cam Bố Hạ bị bệnh và cây không bị bệnh. Tất cả các cây này đều được giám định bệnh bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
Hình 4.7. Cành và lá của cây bị bệnh greening và bệnh tristeza
A. Cây bị bệnh greening; B. Cây bị bệnh tristeza
Để giám định bệnh greening các cây vi ghép, kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu theo công bố của Hung và cs, năm 2004. Trong nghiên cứu này, mẫu lá cam được sử dụng để tách chiết DNA tổng số. Mẫu DNA tổng số được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Nếu mẫu hình thành sản phẩm PCR có
kích thước khoảng 226 bp thể hiện mẫu phân tích bị nhiễm bệnh greening, kết quả PCR âm tính thể hiện mẫu không bị bệnh greening. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng PCR từ mẫu nghiên cứu được thể hiện trong hình 4.8.
Hình 4.8. Kết quả PCR các mẫu lá cây bị bệnh và cây vi ghép
Đường chạy M. Thang chuẩn DNA, đường chạy số 1 và số 2. Mẫu cam Bố Hạ bị bệnh greening sử dụng để lấy mắt ghép; các đường chạy từ số 3 – 20: mẫu các
cây vi ghép
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở hình 4.8 cho thấy: ở đường chạy số 1 và số 2 hình thành 1 băng sản phẩm PCR có kích thước khoảng 226 bp. Đây là sản phẩm đặc hiệu được khuếch đại bởi cặp mồi G-F và G-R từ nguồn mẫu có nhiễm bệnh greening. Chứng tỏ 2 mẫu này nhiễm bệnh greening. Kết quả này cũng phù hợp với kiểu hình cây cam Bố Hạ bị bệnh greening sử dụng để lấy mắt ghép ban đầu.
Các mẫu ở đường chạy từ số 3 đến số 20 không hình thành sản phẩm PCR chứng tỏ các mẫu này không nhiễm bệnh. Kết quả này cho phép khẳng định cả 18 cây cam Bố Hạ vi ghép cải tiến đều không mang mầm bệnh greening. Chứng tỏ rằng kỹ thuật vi ghép cải tiến được phát triển trong nghiên cứu này sạch bệnh dù vật liệu ban đầu là mắt ghép từ cây bị bệnh hoặc cây không bị bệnh greening. Để phát hiện bệnh tristeza, chúng tôi sử dụng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đặc hiệu với virus gây bệnh tristeza do hãng Agritest, Italia cung cấp. Trong kỹ thuật này, mẫu được phát hiện bằng phương pháp hiển thị mầu đặc trưng sử dụng cơ chất là dietanolammine. Nếu giếng ELISA hiển thị màu vàng có cường độ cao hơn so với giếng đối chứng âm tính thể hiện sự có
mặt của kháng nguyên virus gây bệnh tristeza. Ngược lại, các giếng hiển thị màu vàng có cường độ bằng hoặc thấp hơn cường độ màu của giếng đối chứng âm tính khẳng định mẫu phân tích không nhiễm bệnh tristeza.
Kết quả phát hiện bệnh tristeza các cây vi ghép bằng kỹ thuật ELISA được thể hiện trong hình 4.9 dưới đây:
Hình 4.9. Kết quả giám định bệnh tristeza bằng kỹ thuật ELISA
Kết quả giám định bệnh tristeza bằng kỹ thuật ELISA trên hình 4.9 cho thấy: Đối với các mẫu cây bị bệnh tristeza làm mẫu so sánh (giếng 1c, 1d, 3c và 3d), kết quả hiển thị mầu cho thấy cường độ mầu cao hơn so với mẫu kiểm chứng âm tính (giếng 1b và 3b) là phù hợp với kết quả kiểu hình cây bị bệnh. Các giếng phân tích mẫu cây vi ghép đều cho cường độ mầu thấp hơn hoặc bằng cường độ màu của mẫu kiểm chứng âm tính chứng tỏ trong các mẫu phân tích này không chứa kháng nguyên của virus gây bệnh tristeza.