- Các chỉ tiêu theo dõi sẽ được tính toán theo các công thức sau:
Ʃ mẫu nảy chồi (mẫu) Tỷ lệ tái sinh chồi (%)
Tỷ lệ cây sống (%) Hệ số nhân chồi (lần)
Chiều cao TB (cm)
=
Ʃ mẫu cấy ban đầu (mẫu) Ʃ cấy sống sót (cây) =
Ʃ cây ra ngôi (cây) =
Ʃ chồi thu được (chồi) Ʃ chồi cấy ban đầu (chồi) =
Ʃ chiều cao mẫu theo dõi (cm) Ʃ mẫu ban đầu (mẫu)
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian, chất khử trùng đến tỷ lệ vô trùng mẫu cấy Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)
Giai đoạn khử trùng vật liệu nuôi cấy là giai đoạn đầu tiên trong quá trình nuôi cấy in vitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo ra được vật liệu vô trùng sạch bệnh.
Gốc Hg2+ có hoạt tính khử trùng mạnh. Hg2+ gây thoái hóa tổ chức, tạo thành các hợp chất protein rất dễ tan làm tê liệt chức năng của các nhóm thiol (-SH), các hệ thống men cơ bản và oxi hóa khử của tế bào; Hg2+ có thể liên kết với các protein của máu và mô, làm tê liệt và phá hủy tế bào nấm, khuẩn nhanh chóng. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 với nồng độ 0,1%; 0,2%; 0,5% với khoảng thời gian khác nhau: 3 phút, 5 phút và 10 phút. Mẫu đối chứng khử trùng bằng nước cất vô trùng. Kết quả khử trùng được thể hiện ở hình 41. và bảng 4.1.
Hình 4.1. Hình ảnh vào mẫu Kim ngân sống không bị nhiễm sau khi khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 5 phút
Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng, thời gian khử trùng bằng HgCl2 đến hiệu quả vô trùng chồi Kim ngân (sau 4 tuần nuôi cấy)
Công Hóa thức chất (CT) H2O CT1(ĐC) Cất CT2(ĐC) vô CT3(ĐC) trùng HgCl2 CT4 CT5 0,1% CT6 HgCl2 CT7 CT8 0,2% CT9 HgCl2 CT10 CT11 0,5% CT12
thức đối chứng chỉ sử dụng nước cất vô trùng cho kết quả 100% mẫu bị nhiễm. Nguyên nhân nước cất vô trùng không có khả năng diệt khuẩn để tạo mẫu vô trùng.
Khi khử trùng mẫu Kim ngân bằng HgCl2 0,1% trong thời gian từ 3 phút, 5 phút và 10 phút ta thấy kết quả như sau: ở thời gian 3 phút chưa đủ để tiêu diệt hết các vi khuẩn nên tỉ lệ mẫu nhiễm khá cao chiếm 73,33%; tỷ lệ
mẫu chết chiếm 16,67% và chỉ có 10% mẫu sống không nhiễm. Khi tăng thời gian khử trùng lên 5 phút ta được tỷ lệ mẫu sống không nhiễm chiếm 73,33%; tỷ lệ mẫu nhiễm 13,33% và mẫu chết là 13,33%. Tuy nhiên khi tăng lên thời gian 10 phút tỷ lệ mẫu chết tăng lên là 23,33%; tỷ lệ mẫu nhiễm là 13,33% và tỷ lệ mẫu sống không nhiễm giảm xuống 63,33%; nguyên nhân có thể do thời gian khử trùng lâu dẫn đến chết một phần mẫu Kim ngân. Kết quả trên có thể được giải thích như sau: Gốc Hg2+ có hoạt tính, tính khử trùng mạnh, Hg2+ gây thoái hóa tổ chức, tạo thành các hợp chất protein rất dễ tan làm tê liệt chức năng của các nhóm thiol (-SH), các hệ thống men cơ bản và oxi hóa khử của tế bào; Hg2+ có thể liên kết với các protein của máu và mô, làm tê liệt và phá hủy tế bào nấm, khuẩn nhanh chóng.
Khi khử trùng mẫu Kim ngân bằng HgCl2 0,2% thời gian từ 3, 5 đến 10 phút tỷ lệ mẫu chết tăng tương ứng là 56,67%; 83,33% và 96,67%; còn tỷ lệ mẫu sống giảm tương ứng là 36,67%; 16,67% và 3,33%.
Khử trùng mẫu Kim ngân bằng HgCl2 0,5% thời gian từ 3, 5 và 10 phút đều cho tỷ lệ mẫu chết là 100%. Như vậy nồng độ HgCl2 ở 0,5% là vượt ngưỡng nồng độ, dẫn đến mẫu bị chết hoàn toàn. Khi tăng nồng độ và thời gian khử trùng của HgCl2 thì tỷ lệ mẫu chết tăng do mẫu ngâm trong dung dịch khử trùng kéo dài - hóa chất ngấm sâu vào bên trong mẫu gây độc mô nuôi cấy, làm mất khả năng tái sinh chồi.
Căn cứ vào kết quả ở bảng 4.1 ta có thể lựa chọn khử trùng mẫu Kim ngân bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút để đạt kết quả khử trùng tốt nhất, cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao nhất.
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởngđến khả năng nhân nhanh chồi Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.) đến khả năng nhân nhanh chồi Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)
4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanhchồi của mẫu Kim ngân chồi của mẫu Kim ngân
Nhóm cytokinin là nhóm chất kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ, đặc biệt là sự phân hóa chồi, trong một số trường hợp chúng có tác dụng phá ngủ nghỉ của hạt, củ, chồi,... Có ba loại cytokinin chính thường dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kinetin, zeatin và BAP. Trong đó BAP được sử dụng thông dụng nhất, do vậy đã chọn BAP để khảo sát khả năng nhân nhanh chồi in vitro của cây Kim ngân.
Sau 2 tuần vào mẫu vô trùng Kim ngân, sẽ cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung 30g/l saccarose, 6g/l Agar và BAP ở các nồng độ khác nhau. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả nghiên cứu thể hiện ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Kim ngân
Công thức (CT) CT 1 (ĐC) CT2 CT3 CT4 CT5
Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy: Giá trị F lớn hơn Fcrit vậy nên các công thức khác nhau cho hệ số nhân chồi khác nhau. Các thí nghiệm bổ sung BAP đều cho kết quả nhân nhanh chồi cao hơn công thức đối chứng không có bổ sung BAP. Hệ số bật chồi của Kim ngân tăng từ 1,73 lần đến 5,03 lần khi bổ sung BAP từ 0mg/l đến 1 và 2mg/l. Tuy nhiên khi tăng nồng độ BAP lên 3, 4 và 5mg/l thì hệ số bật chồi Kim ngân lại bị giảm xuống tương ứng là 4,17 lần; 3,5 lần và 2,33 lần. Như vậy nhìn vào kết quả trên ta thấy bổ sung BAP 2mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 5,03 lần, chồi khỏe, mập và xanh.
Hình 4.2. Hình ảnh nhân nhanh chồi của mẫu Kim ngân khi môi trường có bổ sung BAP 2 mg/l
Kết quả thu được được giải thích như sau: BAP là một trong các cytokinin có vai trò trong việc hoạt hóa quá trình phân bào, nhờ có tác dụng tái sinh và phân hóa chồi cho cây. Khi tăng dần nồng độ BAP từ 0 đến 2mg/l trong môi trường nuôi cấy thì hệ số nhân chồi cao nhất, chất lượng chồi tốt. Tuy nhiên khi tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 3, 4, 5mg/l không những không cho kết quả cao hơn mà còn có xu hướng giảm là vì hàm lượng BAP cao có thể gây độc cho mẫu, từ đó gây ức chế khả năng tạo chồi cho mẫu Kim ngân.
4.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Kim ngân nhân nhanh chồi Kim ngân
Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi khi bổ sung BAP 2mg/l kết hợp với NAA có dãy nồng độ từ 0,1 đến 0,5mg/l ta được kết quả ở bảng 4.3 dưới đây:
Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Kim ngân
Công Nồng thức BAP (CT) (mg/l) CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6
chồi khác nhau có ý nghĩa. Khi bổ sung NAA có nồng độ từ 0 đến 0,2mg/l thì hệ số nhân chồi lần lượt tăng lên từ 5,03 lần đến 6,67 lần; chiều cao trung
bình của chồi tương ứng từ 1,56cm đến 2,51cm. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ NAA lên 0,3mg/l thì hệ số nhân chồi và chiều cao trung bình của chồi không những tăng lên mà còn có xu hướng giảm xuống. Cụ thể khi nồng độ NAA là 0,3mg/l hệ số nhân chồi giảm xuống còn 6,10 lần; chiều cao trung bình chồi là 2,37cm. Và khi nồng độ NAA tiếp tục tăng lên 0,4; 0,5mg/l thì hệ số nhân chồi tiếp tục giảm còn 5,53 lần và 5,23 lần và chiều cao trung bình chồi giảm từ 2,18cm và 2,04cm.
Như vậy tổ hợp BAP 2mg/l kết hợp với NAA nồng độ 0,2mg/l cho kết quả hệ số nhân chồi lớn nhất là 6,67 lần và chiều cao trung bình chồi là 2,51cm.; chồi khỏe, mập và xanh (Hình 4.4).
Hình 4.3. Mẫu Kim ngân cấy trong môi trường nhân nhanh chồi có bổ sung BAP 2mg/l + NAA 0,2mg/l
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích ra rễ đến khảnăng ra rễ của Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.) năng ra rễ của Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)
Các mẫu chồi đạt tiêu chuẩn về chiều cao và số lá sẽ được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ để tạo cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường cơ bản MS có bổ sung 30g/l saccarose, 6g/l Agar và chất kích thích ra rễ (NAA, IBA) ở các nồng độ khác nhau. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả thu được thể hiện ở bảng dưới:
Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và IBA đến khả năng ra rễ của cây Kim ngân in vitro
Hóa chất
IBA
NAA
ĐC
Kết quả ở bảng 4.4 cho thấy: Giá trị F > Fcrit do vậy ở các nồng độ IBA và NAA khác nhau cho kết quả tạo rễ khác nhau. Khi bổ sung chất ĐHST IBA vào môi trường ra rễ đều cho tỷ lệ ra rễ của các chồi với tỷ lệ biến động từ 33,3% đến 83,3% cao hơn công thức đối chứng không bổ sung chất kích thích ra rễ. Với IBA khi tăng nồng độ từ 0,5 đến 2,0mg/l thì tỷ lệ ra rễ tăng từ
rễ, số rễ/chồi và chiều dài trung bình rễ đều giảm xuống tương ứng là 63,33 ± 3,33% ; 3,4 rễ. Kết quả bảng 4.4 thể hiện ở các nồng độ IBA khác nhau không thực sự ảnh hưởng đến chiều dài củ rễ cây Kim ngân nuôi cấy.
Với chất ĐHST NAA khi tăng nồng độ từ 0,5 đến 1,5mg/l thì tỷ lệ ra rễ tăng từ 40% ± 5,77 lên 93,33% ± 3,33; tương tự số rễ/chồi cũng tăng lên từ 3,07 ± 0,07 rễ lên 3,44 ± 0,13 rễ và chiều dài trung bình của rễ cũng tăng từ 0,63cm ± 0,07 lên 1,59cm ± 0,05. Tuy nhiên, khi nồng độ IBA tăng lên 2mg/l và 2,5mg/l thì tỷ lệ ra rễ, số rễ/chồi và chiều dài trung bình rễ đều giảm xuống.
So sánh giữa hai chất ĐHST IBA và NAA ở các mức nồng độ nghiên cứu ta thấy bổ sung NAA 1,5mg/l vào môi trường cho kết quả ra rễ tốt nhất với tỷ lệ ra rễ đạt 93,33%, số rễ/chồi là 3,44 rễ và chiều dài trung bình rễ là 1,59cm.
Hình 4.4. Hình ảnh cây Kim ngân được cấy trong môi trường có bổ sung NAA 1,5mg/l
4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể đến tỷ lệ sống cây Kim ngân(Lonicera japonica Thunb.) giai đoạn sau in vitro (Lonicera japonica Thunb.) giai đoạn sau in vitro
Giai đoạn chuyển cây in vitro từ trong bình nuôi ra trồng ở vườn ươm là giai đoạn có ý nghĩa quan trọng, quyết định khả nng ứng dụng của toàn bộ quy trình nhân giống cây in vitro vào trong thực tiễn sản xuất. Giai đoạn này thường gặp nhiều khó khăn do cây in vitro đang trong điều kiện ổn định về mặt dinh dưỡng, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng khi tiến hành chuyển cây ra ngoài sẽ làm cây dễ bị sốc về điều kiện sống dẫn tới cây có thể bị chết. Một trong
những yêu cầu của giai đoạn này là xác định được giá thể trồng cây phù hợp để cây Kim ngân in vitro sinh trưởng và phát triển tốt nhất. Để xác định ảnh hưởng của thành phần giá thể trồng cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây Kim ngân in vitro khi đưa ra trồng thử nghiệm ở vườn ươm, chúng tôi tiến hành thử nghiệm với 3 loại giá thể như sau:
CT1: 100% Đất tầng A
CT2: 80% Đất tầng A + 20% Phân chuồng hoai mục CT3: 50% Đất tầng A + 50% Phân chuồng hoai mục
Kết quả theo dõi sau 60 ngày thể hiện ở bảng 4.5 dưới đây:
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của giá thể đến giai đoạn vườn ươm cây Kim ngân sau
Công thức
CT1
CT2
CT3
Từ kết quả bảng 4.5 ta thấy: cây Kim ngân sau in vitro trồng trên các loại giá thể khác nhau thì cho kết quả về tỉ lệ sống và hình thái cây khác nhau. Cây trồng trên CT1 giá thể 100% Đất tầng A cho tỉ lệ sống là 75,55%, cây thân vừa lá xanh đậm. Tiếp đến lần lượt là các công thức giá thể: CT2 80% Đất tầng A + 20% phân chuồng hoai mục cho tỉ lệ sống là 95,55%, cây thân mập, lá xanh đậm; CT3 Giá thể 50% Đất tầng A + 20% Phân chuồng hoai mục cho tỉ lệ sống 51,11%, thân cây nhỏ, lá màu xanh nhạt.
Như vậy có thể kết luận loại giá thể thích hợp cho sự sinh trưởng của cây con Kim ngân trong giai đoạn sau in vitro là giá thể 80% Đất tầng A + 20% Phân chuồng hoai mục.
Hình 4.5. Hình thái Kim ngân sau in vitro sử dụng giá thể: 80% Đất tầng A + 20% Phân chuồng hoai mục sau 10 tuần
PHẦN 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận
1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian, chất khử trùng đến tỷ lệ vô trùng mẫu cấy Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.). Khử trùng mẫu đỉnh
sinh trưởng cây Kim ngân có mắt chồi sinh trưởng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút cho kết quả vào mẫu tốt nhất: tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 73,33%; tỷ lệ mẫu bị nhiễm 13,33% và tỷ lệ mẫu chết là 13,33%.
2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Kim ngân (Lonicera japonica
Thunb.). Tổ hợp BAP 2mg/l với NAA nồng độ 0,2mg/l cho kết quả hệ số
nhân chồi lớn nhất là 6,67 ± 0,12 lần; chồi khỏe, mập và xanh.
3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích ra rễ đến khả năng ra rễ của Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.). Khi bổ sung NAA 1,5mg/l
vào môi trường cho kết quả ra rễ tốt nhất với tỷ lệ ra rễ đạt 93,33% ± 3,33, số rễ/chồi là 3,44 ± 0,13 rễ và chiều dài trung bình rễ là 1,59 ± 0,05cm.
4. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể đến tỷ lệ sống cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.) giai đoạn sau in vitro. Giai đoạn trồng
cây Kim ngân sau in vitro ngoài vườn ươm trên giá thể 80% Đất tầng A + 20% Phân chuồng hoai mục cho kết quả sống cao nhất đạt 95,55%.
5. Xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)
Cây mẹ có hàm lượng dược học cao, sạch bệnh, sinh trưởng phát triển tốt
2
tu
ần
Bước 1: Khử trùng mẫu cây tạo vật liệu khởi đầu
Khử trùng: HgCl2 0,1%, 5 phút -> Mẫu sống chiếm 73,33%,mẫu nhiễm 13,33%, mẫu chết
Bước 2: Nhân nhanh chồi
3-
4
th
án
g
Môi trường nhân nhanh chồi MS + saccarose 20g/l +agar (6g/l) BA 2mg/l + NAA 0,2mg/l -> chồi khỏe mập,xanh, chiều cao 2,51 cm.
Bước 3: Tạo rễ
Môi trường tạo rễ: MS + saccarose 30g/l + 6g/l agar +NAA 1,5 mg/l + IBA 2.0 mg/l -> Tỷ lệ ra rễ đạt 93,33% số rễ/chồi 3,44 rễ chiều dài trung bình 1,59 cm.
Bước 4: Cảm ứng cây 15 n gà y 10 tu ần
Bước 5: Cấy cây vào bầu đất
Giá thể 80% Đất tầng A + 20% Phân chuồng hoai mục.
Cây con cao ≥ 30 cm, số lá từ 4 – 6, số rễ ≥ 3 rễ, thân cây mập,lá màu xanh
Hình 4.6. Sơ đồ quy trình nhân giống in vitro cây Kim ngân
5.2. Kiến nghị
Cần tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố khác đến nuôi cấy
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Lê Trần Bình (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến của cây trồng, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội.
2. Bộ Khoa Học và Công Nghệ (2007). Sách đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb Khoa học tự nhiên & công nghệ, Hà Nội.