PHẦN 3 : ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện Khoa học sự sống Đại học
Thái Nguyên.
Thời gian: Từ tháng 12/2020 đến tháng 7/2021 3.4. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Thu thập mẫu máu của các gia đình cựu chiến binh phơi nhiễm
Nội dung 2: Các thí nghiệm trên DNA bao gồm tách chiết, điện di và khuếch
đại trình tự DNA đích.
Nội dung 3: Giải trình tự và phân tích gene FAT1 thơng qua việc so sánh với
trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen quốc tế.
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu máu
Đến tại nhà các gia đình của người có tiền sử bị phơi nhiễm dioxin để trực tiếp thu mẫu máu ở cả 3 thế hệ ông-bố, mẹ-con. Thao tác lấy máu được thực hiện bởi bác sĩ có chun mơn.
Danh sách thông tin những người liên quan đến phơi nhiễm dioxin được thu thập: + Họ tên, ngày tháng năm sinh, nơi ở hiện tại và các thông tin về dị tật.
Sau khi thu, mẫu máu sẽ được lưu trữ trong ống chống đông EDTA và bảo quản ở 4oC (ngăn mát tủ lạnh).
Những điều cần chú ý khi thu thập mẫu máu:
- Khi tiến hành lấy máu, ngay sau khi vừa cho máu vào ống chống đông phải mix kĩ để chất chống đơng hồ tan hết trong dung dịch máu
3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA
DNA tổng số sẽ được tách chiết từ máu tồn phần của bệnh nhân thiểu năng trí tuệ có liên quan đến phơi nhiễm dioxin và gia đình bằng phương pháp sử dụng bộ KIT Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit. DNA sau khi tách chiết sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose.
Nên tiến hành tách chiết DNA ngay sau khi thu nhận, thời gian tối thiếu là 1 tuần để hiệu quả tách chiết DNA là cao nhất.
Bảng 3.4. Quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu của người liên quan đến dioxin bằng bộ Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit (Theo hướng dẫn của nhà sản
xuất Favor Prep)
Bước 1 Chuyển 200 µl mẫu máu tồn phần vào ống li tâm siêu nhỏ
Bước 2 Nếu cần loại bỏ RNA => bổ sung 4 µl Rnase A 100mg/ml (khơng được
cung cấp trong bộ kit) Bổ sung 20 µl Proteinase K
Bước 3 Bổ sung 200 µl FATG2 Buffer (đếm)
Votex, ủ ở 60 độ trong 30p, thi thoảng votex
Bước 4 Ủ ở 70OC trong 10 phút
Bước 5 Add 200 µl ethanol (96% or 100%). Votex (hơi kĩ)
Bước 6 Spindown để những giọt dụng dịch cịn dính bên thành ống dồn hết xuống
đáy.
Đặt cột mini FATG vào trong ống eppendorf mới, chuyển hỗn hợp ở ống
Bước 7 cũ ( bao gồm cả tủa) cẩn thận sang cột mini FATG. Ly tâm ở tốc độ
13000v/p trong 1 phút. Sau đó đặt cột mini FATG sang ống eppendorf mới (loại bỏ hết phần dịch)
Thêm 400µl W1 buffer vào cột mini FATG, ly tâm ở tốc độ tối đa trong 1
Bước 8 phút, sau đó loại bỏ dịch.
(Đảm bảo rằng ethanol đã được thêm vào W1 Buffer khi mở ra lần đầu) Bổ sung 750µl WASH Buffer vào cột mini FATG, ly tâm ở tốc độ tối đa
Bước 9 trong 1 phút. Sau đó loại bỏ dịch.
(Đảm bảo rằng ethanol đã được thêm vào WASH Buffer khi mở ra lần đầu)
Bước 10 Ly tâm ở tốc độ tối đa trong 3 phút, làm khơ cột
Thêm 100µl Elution Buffer vào ống 1, thêm 50µl Elution Buffer vào ống 2 (hoặc nước có PH 7,5-9) vào màng của cột mini FATG ( đặt sang ống
Bước 11 eppendorf mới) .
Để đứng cột trong 3p, DNA từ màng sẽ rơi xuống ống ( lưu ý khi nhỏ Elution Buffer cần nhỏ chính xác vào màng).
Phương pháp điện di kiểm tra chất lượng DNA
Kiểm tra kích thước và độ nguyên vẹn của DNA bằng phương pháp điện di trên gel Agarose
Bước 1: Đun gel 0,8% để nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 70OC Bc 2: Đổ gel vào khn có cài sẵn răng lược
Bước 3: Đợi cho gel đông lại, nhấc lược ra, tháo khuôn và thả gel vào bể điện di. Bước 4: Bổ sung dung dịch TAE1x vào bể điện di.
Bước 5: Tra mẫu. Mix 0,5µl Midori Green Direct + 5µl mẫu DNA cần kiểm tra. Bước 6: Tiến hành chạy điện di ở 110V trong 30p.
Bước 7: Đặt gel lên máy soi gel để quan sát các băng DNA, chụp ảnh lưu trữ dữ liệu. (Midori Green Direct có tác dụng nhuộm giúp DNA phát huỳnh quang dưới ánh sáng của tia tử ngoại giúp quan sát được các băng vạch DNA).
Bước 8: Đánh giá chất lượng kích thước, nồng độ DNA dựa vào ladder.
Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm tách chiết DNA từ máu của người có liên quan
Phương pháp Số lượng mẫu
3.5.3. Phương pháp PCR
Phản ứng PCR khuếch đại gen FAT1 từ DNA đã được tách chiết từ mẫu máu với cặp mồi đặc hiệu.
a. Tìm ra điều kiện tối ưu để khuyếch đại đoạn gen FAT1
Sử dụng cặp mồi FAT-F và FAT-R để nhân đoạn gen 696 nucleotide trên exon
10của gen FAT1. Đoạn gen có chiều dài 696 nucleotide được nhân lên sử dụng cặp mồi:
FAT-F: 5ʹ-CGTGCCTATTGGAACAGAGATAG-3ʹ FAT-R: 5ʹ-GAATCAGCATCCGTGGTACTT-3ʹ
Nhận thấy sự khó khăn trong việc PCR khuyếch đại đoạn gen FAT1 của người, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm PCR với dải nhiệt độ gắn mồi là 40, 45, 50, 55, 57, 60 để tìm ra điều kiện tối ưu nhất cho phản ứng.
Thí nghiệm 1: Thời gian kéo dài chuỗi
Nhóm nghiên cứu đã tối ưu thời gian kéo dài chuỗi để phù hợp với chiều dài đoạn gen FAT1 là 696 bp. Theo lý thuyết trung bình 60s sẽ tổng hợp được 1 kb => đoạn gen FAT1 có chiều dài ≈ 700 bp sẽ cần ≈ 42s. Thực tế tiến hành chạy 45s.
Thí nghiệm 2: Tối ưu nồng độ DNA khn
DNA tổng số được tách từ máu của người liên quan đến phơi nhiễm dioxin được bảo quản trong tủ lạnh với nhiệt độ -20OC. Nhưng với thời gian lưu trữ lâu và trong quá trình thử nghiệm tìm điều kiện tối ưu phản ứng PCR thì DNA bị rã đơng nhiều lần sẽ suy thối gây khó khăn trong q trình PCR. Vì vậy, với chất lượng DNA khác nhau của từng mẫu nhóm nghiên cứu đã tiến hành tối ưu nồng độ DNA tổng số dùng làm khn cho từng phản ứng PCR (có thể khơng pha lỗng hoặc pha lỗng 10 lần)
Thí nghiệm 3: Tối ưu nhiệt độ gắn mồi
Sử dụng công cụ trực tuyến Oligo Calculator Tên mồi
FAT-F FAT-R Ta ≈ 51OC
Bước gắn mồi được thử nghiệm với dải nhiệt độ như trên hình 6.
b. Thành phần phản ứng PCR Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR Hoá chất DNA templete Primer F Primer R Tag Buffer 10mX dNTP 10mM H2O Tổng thể tích
Trộn đều hỗn hợp sau đó chuyển vào máy PCR, nhiệt độ gắn mồi được tối ưu hoá ở 55OC trong 45 giây. Phản ứng diễn ra trong 35 chu kì. Chu trình nhiệt của phản ứng được thiết lập như sau:
Hình 3.2: Chu trình nhiệt tối ưu của phản ứng PCR khuyếch đại gene FAT1
Sau khi chạy xong phản ứng PCR, kiểm tra sản phẩm bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%
Sản phẩm PCR được bảo quản ở -20OC
các dideoxynucleotide kết thúc chỗi bởi DNA polymerase trong quá trình sao chép DNA trong ống nghiệm.
Nguyên lý: Phương pháp này được thực hiện giống như phản ứng PCR thông
thường bao gồm các thành phần: DNA khuôn, mồi, dNTP, DNA polymerase, buffer, và nước. Điểm khác biệt là phương pháp này có bổ sung thêm một thành phần là các nucleotide biến đổi được gọi là dideoxyribonucleotide (ddNTPs) hay còn được gọi là các nuceotide kết thúc chuỗi. Các nucleotide này thiếu nhóm 3’- OH cần thiết cho sự hình thành liên kết photsphodiester giữa 2 nucleotide khiến DNA polymerase ngưng kéo dài chuỗi, do đó khi DNA polymerase kết hợp một ddNTP một cách ngẫu nhiên, quá trình kéo dài sẽ kết thúc.
Trong giải trình tự Sanger thơng thường, mẫu DNA được chia thành 4 phản ứng riêng biệt và mỗi phản ứng được thêm vào 1 trong 4 loại (ddATP, ddGTP, ddCTP hoặc ddTTP). Trong giải trình tự Sanger tự động, tất cả các ddNTP được trộn trong một phản ứng duy nhất. Các ddNTP được dán nhãn phóng xạ hoặc huỳnh quang và mỗi nucleotide cho một màu riêng biệt để phát hiện trong các máy giải trình tự.
Kết quả của PCR kết thúc chuỗi này là hàng triệu bản sao có độ dài ngẫu nhiên. Sau đó sản phẩm PCR được phân tách bằng cách điện di qua gel. Các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ xuất hiện dưới dạng các đỉnh và các màu đi kèm. Các đỉnh được phát hiện bằng cách sử dụng nguồn laser [30].
3.5.5. Phương pháp phân tích trình tự DNA in silico
- Phân tích trình tự DNA in silico: Kết quả giải trình tự sẽ được phân tích trên
phần mềm Sequence Scanner v1.0 và BioEdit 7.0 để phát hiện các đột biến khi so sánh với trình tự gen FAT1 tham chiếu được cơng bố trên ngân hàng gene NCBI thơng qua chương trình BLAST.
PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Kết quả thu thập mẫu sinh phẩm của người có liên quan tới phơi nhiễm dioxin
Mục đích ban đầu của đề tài là phân tích đột biến gen FAT1 trên ba thế hệ bệnh nhân thiểu năng trí tuệ có liên quan đến phơi nhiễm dioxin. Việc lựa chọn các gia đình cựu chiến binh phơi nhiễm dioxin tình nguyện tham gia nghiên cứu được thực hiện bởi Hội nạn nhân chất độc da cam Tỉnh Thái Nguyên. Trong danh sách 8 gia đình tình nguyện viên tham gia cung cấp mẫu thì chỉ có một gia đình (D) có người cháu (D1) có tình trạng thiểu năng trí tuệ.
Cơng tác thu thập mẫu là rất thách thức, vì vậy bên cạnh mục tiêu ban đầu, nhóm nghiên cứu đã đặt ra mục tiêu thứ hai nhằm khảo sát tính chất gây đột biến DNA trên người bị phơi nhiễm dioxin và sự di truyền của đột biến qua 3 thế hệ. Một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy dioxin có ảnh hưởng lên tồn bộ hệ gene [31] vì vậy có thể sẽ xuất hiện các đột biến tại các vị trí khác nhau trên hệ gene người.
Một hạn chế trong khâu thu thập mẫu là những gia đình ba thế hệ cựu chiến binh phơi nhiễm dioxin cần có đối chứng là mẫu của người bà và người mẹ không liên quan tới dioxin. Tuy nhiên, do một số nguyên nhân mà nhóm nghiên cứu chưa tiếp cận được với những người này.
Bảng 4.1: Danh sách các gia đình 3 thế hệ liên quan đến phơi nhiễm dioxin tình nguyện tham gia nghiên cứu
Thế hệ thứ ba (cháu của cựu chiến binh có biểu
STT Kí hiệu 1 A1 2 B1 3 C1 4 D1 5 E1 6 G1 7 H1
4.2. Kết quả tách chiết DNA
Mẫu máu của người liên quan đến phơi nhiễm dioxin được tách chiết DNA tổng số bằng bộ Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất Favor Prep. Kết quả tách chiết DNA tổng số được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose và trình bày trên hình 4.1.
Hình 4.1: Kết quả tách chiết DNA tổng số 24 mẫu máu đã thu thập được
L: Ladder 1kb của hãng Thermo Siencetific
Đường chạy từ 1→24 (A1→G4) : DNA tổng số được tách từ 24 mẫu máu thu thập được. Thơng tin kí hiệu bệnh nhân được chi tiết trong nhật kí thí nghiệm.
DNA tổng số được tiến hành điện di trên gel agarose 0,80%. Số lượng mẫu nạp trên mỗi làn trên bản điện di là 5uL/mỗi làn.
Kết quả điện di cho thấy các mẫu DNA tổng số thu được có chất lượng đạt u cầu, DNA ít bị đứt gãy, các band sáng và rõ ràng đủ điều kiện để thực hiện phản ứng PCR và các nghiên cứu tiếp theo.
4.3. Kết quả PCR khuyếch đại gen FAT1
PCR khuếch đại gen FAT1 có kích thước 696 bp trên exon 10 của gen FAT1 được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Ngân và cộng sự [18]có trình tự như ở bảng 3.1.
Nhóm nghiên cứu đã lặp lại chính xác điều kiện phản ứng như nghiên cứu gốc nhưng khơng thu được sản phẩm PCR mong muốn. Do đó, chúng tơi đã tiến hành tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng bao gồm (1) nhiệt độ gắn mồi, (2) thời gian kéo dài, (3) nồng độ DNA khuôn theo 3 dải pha lỗng và (4) thể tích của phản ứng. Kết quả tối ưu cho thấy các điều kiện phù hợp nhất cho PCR gen FAT1 sử dụng cặp mồi nói trên bao gồm nhiệt độ gắn mồi 55oC, thời gian kéo dài 45 giây, nồng độ DNA khn pha lỗng 10 lần và thể tích phản ứng 15 uL.
Sau khi đã tối ưu hóa thành cơng điều kiện của PCR, gen FAT1 trên các mẫu nghiên cứu thuộc 3 gia đình đã được khuếch đại. Danh sách 3 gia đình được trình bày trong bảng 4.2 và kết quả điện di trên gel agarose 0.8% của các sản phẩm PCR được trình bày trong hình 4.2.
Bảng 4.2: Danh sách các mẫu thuộc 3 gia đình được tiến hành PCR
Gia đình 1 Gia đình 2 Gia đình 3
L: Ladder 1kb của hãng Thermo Siencetific
Đường chạy từ 1 → 9 : Sản phẩm PCR đoạn gen FAT1
Lượng mẫu nạp trên mỗi làn trên bản điện di là 5 uL/mỗi làn.
Kết quả điện di sản phẩm cho PCR ở hình 4.2 cho thấy tại các đường chạy xuất hiện băng sáng, khơng đứt gãy tuy nhiên vẫn có băng mờ phía dưới có thể là mồi thừa, primer dimers hay các sản phẩm phụ không mong muốn khác. Đối chiếu với thang chuẩn DNA kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với kích thước dự đốn theo lý thuyết ≈700bp. Như vậy có thể tạm thời kết luận PCR đã khuếch đại thành công gen FAT1 từ mẫu máu của người liên quan đến phơi nhiễm dioxin.
4.4. Kết quả giải trình tự và phân tích đột biến gen FAT1
Các sản phẩm PCR gồm 9 mẫu đủ tiêu chuẩn được gửi tới công ty 1st BASE tại Singapore. Tại đây các sản phẩm PCR được tinh sạch trước khi giải trình tự bằng phương pháp Sanger theo cả 2 chiều.
Mục đích của việc giải trình tự gene FAT1 là để xác định và so sánh trình tự gene của người liên quan đến phơi nhiễn dioxin với trình tự gene FAT1 đã được cơng bố trên ngân hàng gene xem liệu trên gene FAT1 của người có tiền sử phơi nhiễm dioxin có đột biến hay khơng và đột biến đấy có di truyền hay khơng.
Đặc trưng của phương pháp giải trình tự Sanger là tín hiệu trình tự sẽ thấp và không rõ ràng ở khoảng 10 nucleotide đầu các điểm trên đỉnh nucleotide có hiện tượng chồng chéo lên nhau, tín hiệu sẽ dần ổn định và rõ ràng ở những nucleotide tiếp theo sau đấy tín hiệu sẽ thấp dần ở một vài nucleotide cuối có thể giải thích do đoạn đầu và đoạn cuối phản ứng giải trình tự khơng ổn định dẫn tới tín hiệu thấp, khi phản ứng ổn định sẽ cho cường độ tín hiệu cao và chính xác. Kết quả giải trình tự 2 chiều được xử lý bằng các phần mềm Sequence Scanner V1.0 và Bioedit.
Trong số 9 mẫu được gửi đi giải trình tự, có 7 mẫu cho chất lượng tốt và 2 mẫu (D2 và E3) khơng đạt u cầu. Tín hiệu giải trình tự của các mẫu được kiểm tra lại bằng phần mềm Sequence Scanner V1.0. Kết quả phân tích của mẫu đại diện được trình bày trên hình 4.3.
A1-F
Hình 4.3: Kết quả phân tích chất lượng tín hiệu giải trình tự của một số mẫu đại diện
Chất lượng của tín hiệu giải trình tự được đánh giá bằng chỉ số giá trị chất lượng (Quality Value - QV) theo ba cấp độ.
Chất lượng giải trình tự thấp, QV khoảng 0-9 (màu đỏ);
Chất lượng giải trình tự trung bình, QV khoảng 20-30 (màu vàng); Chất lượng giải trình tự cao, QV lớn hơn 30 (màu xanh lam).
Phần mềm Bioedit được sử dụng để cắt bỏ những nucleotide có tín hiệu kém. Sau đó, kết quả trình tự riêng biệt tạo ra bởi 2 mồi xuôi và ngược được ghép thành trình tự hồn chỉnh (consensus). Do ảnh hưởng của các yếu tố kỹ thuật, chiều dài của trình tự hồn chỉnh của 3 mẫu có sự biến thiên và được trình bày trong bảng 4.3. Mẫu E1 và E2 có chất lượng giải trình tự thấp hơn so với các mẫu cịn lại, vì vậy độ dài