PHẦN III
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) thu mua tại Bảo Lạc (Cao Bằng).
3.1.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chấtBảng 3.1: Bảng dụng cụ, thiết bị, hóa chất Bảng 3.1: Bảng dụng cụ, thiết bị, hóa chất STT A 1 Bình tam giác 2 Bình định mức 3 Cốc đong 4 Ống đong 5 Pipet
6 Đũa thủy tinh
7 Khay inox 8 Giấy lọc B Hóa chất 1 Cồn thực phẩm 2 Phenol 3 H2SO4 98% 4 Đường D-Glucose C Thiết bị 1 Tủ sấy 2 Cân điện tử
3 Máy siêu âm
4 Máy đo UV-VIS
22
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Thời gian nghiên cứu: Từ 1.1.2021 đến 15.6.2021 3.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu thành phần hóa học của nấm Linh chi đen
- Xác định độ ẩm nguyên liệu bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi
- Xác định hàm lượng tro toàn phần
- Định lượng Polysaccharide tổng số sau trích ly bằng phương pháp so màu
Nội dung 2: Nghiên cứu quá trình trích ly Polysaccharide trong nấm Linh chi đen
- Nghiên cứu lựa chọn nồng độ dung môi trích ly Polysaccharide trong nấm Linh chi đen
- Nghiên cứu lựa chọn thời gian xử lý bằng sóng siêu âm tới hiệu quả trích ly Polysaccharie trong nấm Linh chi đen
- Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ xử lý bằng sóng siêu âm tới hiệu quả trích ly Polysaccharide trong nấm Linh chi đen
- Nghiên cứu lựa chọn tỉ lệ nguyên liệu/dung môi tới hiệu quả trích ly Polysaccharide trong nấm Linh chi đen
- Nghiên cứu lựa chọn thời gian trích ly tới hiệu quả trích ly Polysaccharide trong nấm Linh chi đen
Nội dung 3: Nghiên cứu tạo sản phẩm trà hòa tan từ dịch chiết Polysaccharide tổng số từ nấm Linh chi đen
- Nghiên cứu quy trình sản xuất dự kiến trà hòa tan từ nấm Linh chi đen
3.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.4.1. Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý
Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm nguyên liệu bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi
Nguyên tắc:
Mẫu được sấy ở nhiệt độ 105oC để làm bay hơi lượng nước đến giá trị nhất định. Độ ẩm của nguyên liệu được xác định bằng lượng mẫu còn lại sau khi sấy [13].
Công thức tính:
Độ ẩm (w %) được tính theo công thức sau: m1 – m2
W(%)=
m0
Trong đó:
m1: Khối lượng mẫu + chén sứ trước khi sấy (g) m2: Khối lượng mẫu + chén sứ sau khi sấy (g) m0: Khối lượng của chén sứ (g)
Thí nghiệm 2: Xác định hàm lượng tro toàn phần
- Nguyên tắc: Dùng nhiệt độ cũng như sức nóng ở (550 – 600oC) nung, đốt cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Hàm lượng tro tổng số của nguyên liệu được xác định bằng khối lượng của chén sứ sau khi nung.
- Tiến hành: Nung chén sứ đã được rửa sạch ở lò nung ở nhiệt độ 550oC – 600oC cho đến khi trọng lượng không đổi. Để nguội chén sứ có cả nguyên liệu ở bình hút ẩm và sau đó đi cân ở cân phân tích chính xác đến 10-4 g. Cho khoảng 2g nguyên liệu vào chén sứ đã chuẩn bị, rồi cân tất cả chính xác bằng cân phân tích. Cho tất cả chén sứ vào lò nung và điều chỉnh nhiệt độ ở 550 – 600oC. Nung trong khoảng thời gian 6-7 giờ cho tới khi thu được tàn tro trắng. Trong trường hợp tro còn đen, thì lấy ra để nguội sau đó cho thêm vài giọt H2O2 hoặc HNO3 đậm đặc và tiếp tục nung lại cho đến khi tro trắng rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân bằng cân phân tích. Tiếp tục nung thêm
ở nhiệt độ trên thêm 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm và đi cân bằng cân phân tích, lặp lại thao tác này cho tới trọng lượng mẫu trong chén sứ thay đổi không đáng kể. Kết quả giữa 2 lần nung và cân liên tiếp nhỏ hơn 0,0005g [14].
- Tính kết quả: Hàm lượng tro theo phần trăm tính bằng công thức :
G2- G
X= x 100
G1-G Trong đó: X: Hàm lượng tro (%)
G1: Khối lượng chén nung và mẫu (g) G : Khối lượng chén nung (g)
24
Chú ý: Khi chén sứ sau khi lấy ra từ lò nung còn nóng nên cho vào bình hút ẩm nhớ để nắp hé mở hoặc mở lỗ không khí ở trên nắp bình hút ẩm tránh không khí nóng từ chén sứ nở ra đẩy bật làm vỡ nắp bình.
Thí nghiệm 3: Định lượng Polysaccharide tổng số sau trích ly bằng phương pháp so màu
Polysaccharide được định lượng bằng phương pháp phenol-sunfuric axit. Các bước được mô tả tóm tắt như sau: 400 µl dịch mẫu chứa Polysaccharide cho tác dụng với 200 µl dung dịch phenol 5%, cho thêm 1ml H2SO4 đậm đặc và để 30 phút ở nhiệt độ phòng. Màu của phản ứng được phát hiện trên máy quang phổ ở bước sóng 490 nm. Hàm lượng Polysaccharide được định lượng dựa trên số đo OD thu được của mẫu thí nghiệm đối chiếu với đồ thị chuẩn glucose ( Foster D. S & cs,1961).
Các hóa chất như sau:
- Dung dịch phenol 5%
- Axit sunfuric đậm đặc
- Dung dịch glucose chuẩn
3.4.2. Phương pháp phân tích các yếu tố ảnh hưởng tới trích ly Polysaccharide từ nấm Linh chi đen nấm Linh chi đen
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung môi tới hiệu quả trích ly Polysaccharide từ nấm Linh chi đen.
Mục đích: Lựa chọn được nồng độ dung môi cho hiệu quả trích ly cao nhất. Sử dụng ethanol để trích ly Polysaccharide tổng số, nghiên cứu thay đổi nồng độ ethanol từ 60 đến 90o. Cố định các yếu tố khối lượng mẫu, nhiệt độ xử lí sóng siêu âm, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian siêu âm và thời gian trích ly. Bố trí thí nghiệm được bố trí theo bảng dưới đây:
Công thức
CT1
CT2
CT3
25
Dịch trích ly đem lọc qua giấy lọc thô 2 lần và lọc qua giấy lọc tinh 1 lần. Mỗi công thức lặp lại 3 lần. Dựa vào hàm lượng Polysaccharide tổng số thu được lựa chọn được nồng độ dung môi tối ưu nhất.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lí bằng sóng siêu âm tới hiệu quả trích ly Polysaccharide tổng số trong nấm Linh chi đen
Tiến hành khảo sát xử lí sóng siêu âm ở các khoảng thời gian 0, 2, 4, 6, 8 phút. Nồng độ của dung môi được lựa chọn từ thí nghiệm 4, cố định các yếu tố như khối lượng mẫu,tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, nhiệt độ siêu âm và thời gian trích ly. Bố trí thí nghiệm được bố trí theo bảng dưới đây:
Công thức CT6 CT7 CT8 CT9 CT10
Dịch trích ly đem lọc qua giấy lọc thô 2 lần và lọc qua giấy lọc tinh 1 lần. Mỗi công thức lặp lại 3 lần. Dựa vào hàm lượng Polysaccharide tổng số thu được lựa chọn được thời gian xử lý sóng siêu âm tối ưu.
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ xử lí bằng sóng siêu âm tới hiệu quả trích ly Polysaccharide trong nấm Linh chi đen
Tiến hành khảo sát ở các mức nhiệt độ 30, 40, 50, 60oC. Nồng độ dung môi được lựa chọn ở thí nghiệm 4 và thời gian xử lý sóng siêu âm được lựa chọn từ thí nghiệm
26 Công thức CT11 CT12 CT13 CT14
Dịch trích ly đem lọc qua giấy lọc thô 2 lần và qua giấy lọc tinh 1 lần, mỗi công thức lặp lại 3 lần. Dựa vào hàm lượng Polysaccharide tổng số thu được lựa chọn nhiệt độ siêu âm tối ưu nhất.
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu lựa chọn tỉ lệ nguyên liệu nấm Linh chi đen với dung môi trích ly.
Tiến hành khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml) theo 1/10, 1/15, 1/20. Nồng độ dung môi được chọn ở thí nghiệm 4, thời gian và nhiệt độ siêu âm được lựa chọn ở thí nghiệm 5 và 6. Cố định các yếu tố như khối lượng mẫu, thời gian trích ly. Bố trí thí nghiệm được bố trí theo bảng dưới đây:
Công thức
CT15
CT16
27
Dịch trích ly đem lọc qua giấy lọc thô 2 lần và lọc qua giấy lọc tinh 1 lần. Mỗi công thức lặp lại 3 lần. Dựa vào hàm lượng Polysaccharide tổng số thu được lựa chọn tỉ lệ tối ưu nhất.
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu lựa chọn thời gian trích ly Polysaccharide từ nấm Linh chi đen.
Nghiên cứu thay đổi thời gian trích ly từ 60 đến 180 phút. Nồng độ dung môi được chọn ở thí nghiệm 4, thời gian và nhiệt độ siêu âm được chọn ở thí nghiệm 5 và 6, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi được chọn ở thí nghiệm 7 và cố định khối lượng mẫu. Bố trí thí nghiệm được tiến hành theo bảng dưới đây:
Công thức CT18 CT19 CT20 CT21 CT22
Dịch trích ly đem lọc qua giấy lọc thô 2 lần và lọc qua giấy lọc tinh 1 lần. Mỗi công thức lặp lại 3 lần. Dựa vào hàm lượng Polysaccharide tổng số thu được lựa chọn được thời gian trích ly tối ưu nhất.
Thí nghiệm 9: Nghiên cứu quy trình sản xuất dự kiến trà hòa tan Nấm Linh chi đen Cao cỏ ngọt Trà hòa tan