Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Lồi Mỡ Phú Thọ (Magnolia chevalieri Dandy V.S.Kumar)

Lồi Mỡ Phú Thọ cĩ tên khoa học là Magnolia chevalieri (Dandy) V. S. Kumar., thuộc chi Mộc Lan (Magnolia), họ Ngọc Lan (Magnoliaceae). Mẫu cành và lá được thu tại khu bảo tồn thiên nhiên Na Hang, huyện Na Hang, tỉnh Tuyên Quang, Việt Nam vào tháng 7 năm 2017. Tên khoa học được giám định bởi PGS. TS. Vũ Quang Nam (Đại học Lâm nghiệp Hà Nội) và Th.S. Trịnh Ngọc Bon (Học viện Khoa học Lâm nghiệp). Mẫu tiêu bản (TQ1701) được lưu giữ tại Viện Sinh Thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, Hà

Nội.

Hình 2.1. Mẫu hoa và lá lồi Mỡ Phú Thọ thu tại Tuyên Quang, Việt Nam

2.1.2. Lồi Giởi đá (Magnolia insignis Wall.)

Lồi Giổi đá cĩ tên khoa học là Magnolia insignis, thuộc chi Mộc Lan (Magnolia), họ Ngọc Lan (Magnoliaceae). Mẫu cành và lá được thu tại tỉnh Tuyên Quang, Việt Nam vào tháng 7 năm 2017 và được giám định tên khoa học bởi Th.S. Trịnh Ngọc Bon (Học viện Khoa học Lâm nghiệp). Mẫu tiêu bản (TQ1703) được lưu giữ tại Viện Sinh Thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, Hà Nội.

2.1.3. Lồi Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba DC.)

Lồi Ngọc lan hoa trắng cĩ tên khoa học là Michelia alba DC. (hay Michelia

longifolia var. racemosa Blume.)), thuộc chi Ngọc lan hay chi Giổi (Michelia), họ

Ngọc Lan (Magnoliaceae).

Mẫu cành, lá, thân và rễ được thu tại Núi Luột, Đại học Lâm nghiệp, thị trấn Xuân Mai, huyện Chương Mỹ, Hà Nội, Việt Nam vào tháng 7 năm 2018 và được giám định tên khoa học bởi TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, Hà Nội). Mẫu tiêu bản (NLT01) được lưu giữ tại Viện Hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, Hà Nội.

1. Lá và hoa; 2. Vỏ thân; 3. Rễ

Hình 2.3. Mẫu lồi Ngọc lan hoa trắng thu tại Xuân Mai, Hịa Bình

Mẫu thứ hai (lá và cành) được thu tại thành phố Đồng Hới, tỉnh Quảng Bình, Việt Nam vào tháng 1 năm 2020 và được giám định tên khoa học bởi TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, Hà Nội). Mẫu tiêu bản (NLT02) được lưu giữ tại Viện Hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, Hà Nội.

1. Hoa; 2. Lá; 3. Cành

2.2. Hĩa chất, thiết bị nghiên cứu

2.2.1. Hĩa chất

Sắc ký bản mỏng: Sư dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60F254, cĩ độ dày 0,2 mm.

Sắc ký cột thường: silica gel cỡ hạt 197- 400 mesh (0,040 - 0,063 mm) cho cột đầu. Sắc ký cột nhanh: silica gel cỡ hạt 70 - 200 mesh cho cột tiếp theo. Sắc ký cột pha đảo: Rp-18. Sắc ký lọc gel: Sephadex LH-20 Merck, nhựa Diaion HP-20.

Dung mơi dùng rưa giải bao gồm n-hexane, dichlomethane, ethyl acetate, acetone, methanol đã được cất lại qua cột Vigreux trước khi sư dụng.

Một số hĩa chất khác để pha thuốc thư như vanilin, CH3COOH, axit H2SO4, thuốc thư Dragendorf dùng cho các chất alkaloid.

2.2.2. Thiết bị

Phổ hồng ngoại FT-IR được đo dưới dạng viên nén KBr bằng máy IMPACT 410, Nicolet-Carl Zeiss Jena (Đức) tại Viện Hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi bằng máy Bruker Avance 500 MHz (Đức) tại Viện Hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

Phổ khối ESI-MS được đo trên máy Agilent LC-MSD-Trap SL tại Viện Hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam và máy AMD 402 (Đức). Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy FT-ICR-MS Varian (USA), tại Viện Hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

Độ quay cực được đo trên thiết bị Jasco P-2000 Polarimeter serial A060161232, Viện Hĩa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

Máy sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) của hãng Agilent Technologies HP 6890 N tại Viện Hĩa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

Máy cất quay chân khơng của hãng Buchi Thụy Sĩ, máy sấy, siêu âm, dụng cụ thủy tinh, đèn tư ngoại (UV Bloblock) bước sĩng λ = 254 nm và 365 nm, các loại cột sắc ký với kích cỡ khác nhau.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật

Mẫu thực vật sau khi rưa sạch, sấy khơ, xay nhỏ thành bột được chiết theo một trong hai cách:

Chiết tổng: Chiết mẫu thực vật với dung mơi MeOH, EtOH hoặc hỗn hợp

loại dung mơi bằng máy cất quay thu được cao chiết tổng. Sau đĩ, hịa cao tổng vào nước và chiết phân lớp lần lượt với các dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần n-hexan,

EtOAc và BuOH (3 - 4 lần/ mỗi loại dung mơi). Cất loại dung mơi bằng máy cất quay thu được các cặn chiết tương ứng.

Chiết lần lượt: Mẫu thực vật được chiết lần lượt với các dung mơi cĩ độ

phân cực tăng dần dần n-hexan, EtOAc, BuOH và MeOH hoặc MeOH/H2O (3 - 4 lần/ mỗi loại dung mơi). Cất loại dung mơi bằng máy cất quay thu được các cặn chiết tương ứng.

2.3.2. Phương pháp phân lập, tinh chế các hợp chất

 Sắc ký bản mỏng

Sư dụng phương pháp SKBM một chiều với kỹ thuật giải ly bằng dung mơi đi lên, chất hấp thu Silica gel 60 F254 (Merck), loại tráng trên bản nhơm độ dày 0.2 mm. Hiện hình các vết sau khi giải ly bằng ánh sáng UV ở bước sĩng λ = 254 nm và phun xịt thuốc thư vanilin/ H2SO4 (vanilin 1.2 g; MeOH 200 mL; CH3COOH 25 mL; H2SO4 11 mL). Ngồi ra, cịn sư dụng thuốc thư Dragendoff đặc hiệu để nhận biết alkaloid.

 Sắc ký bản mỏng điều chế

Sắc ký bản mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck), hiện hình các vết sau khi giải ly bằng ánh sáng UV ở bước sĩng λ = 254nm và

365nm, vẽ bằng bút chì ranh giới vệt chất cần tách rồi dùng kéo cắt phần bản mỏng theo đường vẽ bút chì. Sau đĩ, cạo lớp Silica gel cĩ chất cần tách, giải hấp và tinh chế lại trong dung mơi thích hợp hoặc sắc ký cột.

 Sắc ký cột

Sư dụng phương pháp sắc ký cột thường với các chất pha tĩnh khác nhau như Silica gel 60 (kích thước hạt 0,063 - 0,040mm, Merck, 230 - 430 mesh ASTM), RP18, sephadex LH-20 với kích thước cột và dung mơi thích hợp với từng phân đoạn.

 Kết tinh lại

Một số chất phân lập được ở dạng rắn với lượng tương đối lớn cĩ thể tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại. Chọn dung mơi (hay hỗn hợp dung mơi) hịa tan chất cần kết tinh khi đun nĩng và ít hịa tan chất đĩ khi làm lạnh. Khi làm lạnh dung dịch bão hịa, chất kết tinh lắng xuống ở dạng tinh thể cịn tạp chất ở lại trong dung dịch (nếu tạp chất khơng tan khi đun nĩng thì cần lọc bỏ rồi làm lạnh dung dịch bão hịa).

2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ tư ngoại (UV-Vis), phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H- NMR, 13C- NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY).

2.3.4. Phương pháp chưng cất lơi cuốn hơi nước để chiết xuất tinh dầu

Phương pháp chưng cất lơi cuốn hơi nước dựa trên sự khuếch tán và lơi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao. Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hịa trong một thời gian nhất định. Ngay khi nguyên liệu được làm vỡ vụn thì chỉ cĩ một số mơ chứa tinh dầu bị vỡ và cho tinh dầu thốt tự do ra ngồi theo hơi nước lơi cuốn đi. Tinh dầu cịn lại trong các mơ thực vật sẽ tiến dần ra ngồi bề mặt nguyên liệu bằng sự hịa tan và thẩm thấu. Ở nhiệt độ nước sơi, một phần tinh dầu hịa tan vào trong nước cĩ sẵn trong tế bào thực vật. Dung dịch này sẽ thẩm thấu dần ra bề mặt nguyên liệu và bị hơi nước cuốn đi. Cịn nước đi vào nguyên liệu theo chiều ngược lại và tinh dầu lại tiếp tục bị hịa tan vào lượng nước này. Quy trình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các mơ thốt ra ngồi hết.

2.3.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro

Các dịng tế bào ung thư ở người gồm: Ung thư biểu mơ (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (Lu), ung thư vú (MCF-7). Các dịng ung thư được GS. J. M. Pezzuto, trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp

 Phương pháp nuơi cấy tế bào in vitro

Các dịng tế bào ung thư được nuơi cấy dưới dạng đơn lớp trong mơi trường nuơi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1.0 mM sodium pyruvate, ngồi ra bổ sung 10% fetal bovine serum - FBS (GIBCO).Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuơi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2.

 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)

Phương pháp thư độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thư độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất cĩ khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thư này được thực hiện theo phương pháp của Monks. Phép thư tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng

Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tư protein, do đĩ lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thư được thực hiện ở điều kiện cụ thể như sau:

 Chất thư (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để cĩ nồng độ sàng lọc là 20 g/ml. Chất thư cĩ hoạt tính được xác định IC50 nhờ dải nồng độ 20 g/ml; 4 g/ml; 0,8 g/ml; 0,16 g/ml.

 Trypsin hĩa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

 Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 l mơi trường) và để chúng phát triển trong vịng từ 3-5 ngày.

 Một khay 96 giếng khác khơng cĩ chất thư nhưng cĩ TBUT (180l) sẽ được sư dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng acid trichloracetic -TCA.

 Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37oC. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rưa 3 lần bằng 5% acid acetic rồi để khơ trong khơng khí ở nhiệt độ phịng.

 Cuối cùng, sư dụng 10 mM unbuffered Tris base để hịa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tư protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sư dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sĩng 515 nm. Khả năng sống sĩt của tế bào khi cĩ mặt chất thư sẽ được xác định thơng qua cơng thức sau:

% sống sĩt =

[OD (chất thư) - OD (ngày 0)] OD (đối chứng âm) - OD (ngày

x 100%

% ức chế = 100% - % sống sĩt

Các phép thư được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luơn được sư dụng như là 0,08 g/ml. DMSO 10% luơn được sư dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính Table Curve. chất đối chứng dương và được thư nghiệm ở các nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml;

 Phương pháp thử hoạt tính ức chế sản sinh NO

- Lipopolysaccharides (LPS) từ Escherichia-coli của Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) were from Life Technologies, Inc., (Gaithersburg, MD, USA). Sodium nitrite, sulfanilamide, N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride và dimethyl sulphoxide (DMSO) của Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Các hĩa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen, Promega v.v.

- Dịng tế bào: RAW 264.7 do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.

 Phương pháp nuơi cấy tế bào in vitro

- Dịng tế bào RAW 264.7 được nuơi cấy trong mơi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES và 1,0 mM sodium pyruvate, ngồi ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).

- Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuơi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2.

 Phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7.

- Tế bào RAW 274.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 1 x 104 tb/giếng và nuơi trong tủ ấm ở 37oC và 5% CO2 trong 24h.

- Tiếp theo, mơi trường nuơi cấy được loại bỏ, thay bằng mơi trường DMEM khơng cĩ FBS trong 3h.

- Tế bào sau đĩ được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1µg/mL) trong 24h.

- Một số giếng khơng được ủ mẫu mà chỉ sư dụng dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng âm. Trong khi đối chứng dương được sư dụng là NG-Methyl-L- arginine acetate (L-NMMA) (Sigma).

- Nitrite (NO -), được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Cụ thể là, 100 µL mơi trường nuơi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thêm vào 100 µL Griess reagent: 50 µL of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) phosphoric acid và 50 µL 0,1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nước.

- Hỗn hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phịng trong 10 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo bằng máy microplate reader ở bước sĩng 540 nm. Mơi trường DMEM khơng FBS được sư dụng như giếng trắng (blank).

- Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS).

- Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ cơng thức:

% ức chế =100% - [hàm lượng NOsample/hàm lượng NOLPS] x 100

- Phép thư được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

 Phép thử sinh học xác định khả năng gây độc tế bào bằng MTT

- Chất thư (20 µl) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để cĩ nồng độ tương tự nồng độ của thí nghiệm NO.

- Sau khi điều chỉnh để cĩ mật độ tế bào phù hợp, hút 180 µl tế bào vào các giếng của khay 96 giếng đã cĩ chất thư. Trên cùng một đĩa thư, bố trí một số giếng để làm đối chứng khơng cĩ mẫu thư, chỉ cĩ dung mơi pha mẫu là DMSO 10%.

- Để đĩa nuơi cấy vào trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2, nuơi trong thời gian 72 giờ.

- Sau 72 giờ, 10µl MTT (nồng độ cuối cùng là 5 mg/ml) được cho vào mỗi giếng. - Sau 4h, loại bỏ mơi trường, tinh thể formazan được hịa tan bằng 50µl (DMSO) 100%.

- Giá trị OD đo ở bước sĩng 540 nm bằng máy quang phổ. - Lượng tế bào sống sĩt sẽ được tính theo cơng thức:

% sống sĩt

= OD(chất thư) - OD(đối chứng)

OD(DMSO) - OD(đối chứng) x 100%

2.4. Chiết xuất và phân lập các chất từ lồi Mỡ Phú Thọ

2.4.1. Chiết xuất các cặn chiết từ lá

Mẫu lá lồi Mỡ Phú Thọ (Magnolia chevalieri; 1.2 kg) được rưa sạch, cắt nhỏ, phơi khơ, xay thành bột rồi ngâm chiết lần lượt với các dung mơi n-hexan, EtOAc và MeOH : H2O (9 :1). Sau khi cất loại dung mơi ở áp suất thấp thu được các cặn chiết tương ứng: n-hexane (MC1; 5.0g), EtOAc (MC2; 40.6g) và MeOH : H2O (MC3; 46.3g).

Sau khi tiến hành khảo sát sơ bộ bằng sắc ký bản mỏng các cặn chiết thu

Tổng quan về lồi Giổi đá (Magnolia insignis)

Hĩa chất, thiết bị nghiên cứu