THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệ u, hóa ch ấ t, thi ế t b ị
2.2.4. Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học
2.2.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định * Các chủng vi sinh vật và nấm kiểm định :
Vi khuẩn gram (-):
+ Pseudomonas aeruginosa (Pa) ATCC 15442,
+ Escherichia coli (Ec) ATCC 25922
+ Salmonella enterica (Se) Vi khuẩn gram (+):
+ Staphylococcus aureus (Sa) ATCC 13709. + Bacillus subtillis (Bs) ATCC 6633
Và nấm:
+ Candida albicans (Ca) ATCC 10198.
* Môi trường nuôi cấy: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller- Hinton Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi sinh vật; SAB, SA cho nấm.
* Phương pháp: Phương pháp pha loãng nồng độ
- Mẫu ban đầu được pha trong DMSO với nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử.
- Các mẫu được pha thành dãy các nồng độ khác nhau (từ 5 đến 10 nồng độ).
- Mẫu ban đầu có nồng độ 40 mg/ml được pha loãng thành các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng: 256; 64; 16; 4 và 1 g/ml.
- Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105 cfu/ml khi tiến hành thử.
- Lấy 10 l dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã pha loãng, thêm 200
l dung dịch vi sinh vật và nấm, ủở 37 0C. Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy Tecan (Genios) và phần mềm raw data.
* Chất đối chứng
- Kháng sinh Ampicilin cho các chủng vi khuẩn gram (+) và chủng vi khuẩn gram (-) Ec với giá trị IC50 trong khoảng 0,05 – 2 g/ml.
- Hỗn hợp kháng sinh Pen/Step cho chủng vi khuẩn gram (-) Pa với giá trị IC50 trong khoảng 4 – 5 g/ml.
- Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5 – 1 g/ml. 2.2.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào
* Các dòng tế bào: các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC, gồm có:
- KB (Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mô – là dòng luôn được sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào.
- Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) – ung thư gan. - LU (Human lung carcinoma) – ung thư phổi. - MCF – 7 (Human breast carcinoma) – ung thư vú.
* Phương pháp: phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
- Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37 0C; độẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau.
* Thử độc tế bào:
- Cho 200 l dung dịch tế bào ở pha lỏng nồng độ 3.104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào HepG2, MCF7, KB; môi trường DMEM cho LU-1.
- Mẫu thử được xử lí với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128; 32; 8; 2; 0,5 g/ml. Ủ trong điều kiện 37 0C, 5% CO2 trong 3 ngày.
- Giếng điều khiển gồm 200 l dung dịch tế bào nồng độ 3.104 tế bào/ml, ủở 37 0C, 5% CO2 trong 3 ngày, thêm 50 l MTT (1 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ 37 0C 4 giờ.
- Loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO, lắc đều, đọc kết quảở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.
GI%: Phần trăm kìm hãm sự phát triển ( Growth Inhibition).
Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả GI% của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.
2.2.4.3. Hoạt tính chống oxy hóa
* Phương pháp thử hoạt tính DPPH
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng = 517 nm.
Cách tiến hành: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong methanol (MeOH). Chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt được một dãy các nồng độ 128; 32; 8; 2; 0,5 g/ml. Để thời gian phản ứng 30 phút ở 37 0C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở bước sóng 517 nm. % quét gốc tự do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:
SC% = (OD trắng – OD mẫu thử)/ ODtrắng (%).
EC50 (nồng độ có hiệu lực với 50% cá thể) được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3.
Đồ thị tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH y = 0.3225x + 0.0241 R2 = 0.9938 0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 1.6000 1.8000 0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000 Nồng độ DPPH mM M ậ t đ ộ q u a n g h ọ c ( O D ) * Phương pháp thử hoạt tính peroxydaza
Nguyên liệu: Máu tươi được chống đông bằng ADC (Adenine dextrose citrate), pha loãng 10-20 lần bằng nước cất. Chia thành các ống nhỏ 0,5-1 ml. Dùng cho thí nghiệm cất trong tủ lạnh -80oC. Khi dùng pha loãng thêm 25- 50 lần bằng RB.
H2O2 (0,2 N hay 2%).
Indigocarmin: chuẩn bị dung dịch stock-80 0C: 0,1 N, pha loãng 100 lần sẽ thu được dung dịch phản ứng 0,001 N.
Chất thử:
-Pha loãng bằng DMSO: dịch gốc 20 mg/ml, tiếp theo pha loãng 1:4 tạo thành 1 dãy 5 nồng độ.
-Pha loãng bằng dung dịch đệm: tạo một dãy 5 nồng độ mới từ dãy nồng độ trên bằng cách pha loãng 7,8 lần với dung dịch đệm.
Phản ứng:
50 l dung dịch đệm axetat natri pH 4,7 0,1 N
10 l chất thử pha trong DMSO và RB
60 l enzyme pha loãng 500 lần
60 l H2O2 0,2N hay 2%
50 l TCA 20%
Giếng điều khiển âm không có enzim, không có chất thử, giếng điều khiển dương enzim hoạt động 100%, không có chất thử.
Để thời gian phản ứng ở nhiệt độ phòng trong vòng 20-25 phút, dừng phản ứng bằng TCA. Đọc kết quảở bước sóng 610 nm.