- Tìm thấy trứng SLGL trong phân đ−ợc xem là chẩn đoán “vàng”. Tuy nhiên xét nghiệm tìm thấy trứng SLGL có tỷ lệ rất thấp nên cần dựa vào hội chứng gồm nhiều triệu chứng, trong đó xác định có kháng thể đặc hiệu trong máu là dấu hiệu quan trọng[1], [10].
- Elisa d−ơng tính với hiệu giá kháng thể từ 1/3200 là tiêu chuẩn chẩn đoán xác định trong nghiên cứu này.
- Các tiêu chuẩn còn lại để hỗ trợ chẩn đoán gồm:
+ Khám lâm sàng: đau tức vùng gan, sốt, mẩn ngứa, RLTH + Bạch cầu ái toan tăng trên 8%
+ Hình ảnh siêu âm có tổn th−ơng điển hình do SLGL - Một số yếu tố liên quan
+ Tiền sử th−ờng xuyên ăn rau thủy sinh sống. + Trong ốc có ấu trùng SLGL
+ Trong rau thuỷ sinh có ấu trùng SLGL + Có trứng SLGL trong phân trâu bò + Tìm thấy SLGL trong gan trâu, bò
2.6 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
2.6.1 Kỹ thuật xét nghiệm phân theo ph−ơng pháp Kato-Katz.
Xét nghiệm phân để tìm trứng SLGL bằng ph−ơng pháp Kato-Katz[30]. - Dùng que lấy một l−ợng phân bằng hạt ngô (5g) để trên giấy thấm. - Đặt miếng l−ới lên trên mẫu phân, dùng que ấn miếng l−ới và vét lấy
phân trên l−ới.
- Đặt tấm đong lên trên lam kính, cho phân vừa lọc vào đầy hố đong. Gạt nhẹ trên miệng hố để loại phần phân thừa.
- Cẩn thận nhấc tấm đong sao cho phần phân trong hố đ−ợc giữ lại trên lam
- Phủ trên phân mảnh cellophane đã đ−ợc ngâm tr−ớc trong dung dịch xanh malachit.
- Dùng nút cao su ấn nhẹ phân qua mảnh cellophane để phân dàn đều d−ới mặt tiếp xúc của nút cao su.
- Nhấc nút cao su khỏi lam kính. Mảnh cellophane còn giữ lại trên lam và tác dụng thay cho lá kính 30.
- Đặt tiêu bản lên mâm kính soi phát hiện trứng sán sau khi thấy tiêu bản trong và khô (th−ờng sau 15 phút khi trời khô hanh, sau 30 phút đến 1 giờ khi trời ẩm −ớt).
- Kỹ thuật Kato-Kazt đ−ợc đếm toàn bộ số trứng/lam, sau đó nhân với hệ số 24 để đ−ợc số trứng/gam phân. Hệ số này thay đổi tùy theo đ−ờng kính lỗ đong và độ dày tấm đong.
- L−u ý: hệ số 24 chỉ dùng với tấm đong có đ−ờng kính lỗ đong 6mm và độ dày tấm đong 1,5mm.
2.6.2 Kỹ thuật ELISA.
Một quy trình mới đ−ợc thiết lập tại Labo của khoa xét nghiệm -Viện Sốt Rét- Ký Sinh Trùng-Côn Trùng-Trung Ương. Từng mẫu huyết thanh đ−ợc chẩn đoán kháng thể kháng F. gigantica l−u hành trong máu bằng kỹ thuật ELISA.
Kỹ thuật [47].
- Các đĩa 96 giếng (Nunc Maxisorp) đ−ợc phủ 100mcl kháng nguyên ES (kháng nguyên đ−ợc tách chiết từ sán tr−ởng thành F. gigantica của Viện khoa học công nghệ Việt Nam) nồng độ 1mcg/ml ES antigen trong
Photphate buffer saline (PBS, pH 7.2)(NISSUI Pharmaceutical co.,ltd, Japan) ủ qua đêm ở 400C .
- Ngày hôm sau rửa ba lần bằng dung dịch photphat buffer saline containing 0,05% Tween-20(PBST) và cố định bằng 100mcl dung dịch 1% BSA trong PBS (BSA/PBS), sau đó ủ 1 giờ ở 37độC và rửa lại 3 lần bằng dung dịch rửa.
- Các mẫu huyết thanh(bao gồm cả 2 chứng d−ơng, 8 chứng âm), sau khi pha loãng1/400 trong 1% BSA/PBST thì mỗi mẫu 100mcl đ−ợc cho vào các giếng.
- Sau khi ủ 1h tại 37độC, rửa lại 3 lần, tiếp tục nhỏ 100mcl kháng thể IgG ng−ời gắn HRP (horsera dish peroxidase) của hãng Southern Biotech-USA
tỷ lệ 1% BSA/PBS vào từng giếng. Đĩa đ−ợc ủ 1h ở 37độC.
- Rửa đĩa sau rửa 3 lần bằng dung dịch PBST ấm và 3 lần bằng n−ớc cất. Thêm 100mcl substrate (ABTS:H2O2 tỷ lệ 1:1)(KPL,USA).
- Độ pha loãng của từng giếng đ−ợc đọc ở b−ớc sóng 405nm bằng máy đọc ELISA (Thermo Labsystems, Multiskan JX).