CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4. Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của viên hoàn
2.2.4.1. Động vật thử nghiệm
Chuột, giống đực và cái, chủng Swiss albino, 6 tuần tuổi, cân nặng 18 –
24 g, được cung cấp bởi Viện Vắcxin và Sinh phẩm y tế Nha Trang. Sử dụng chuột khỏe mạnh, không có biểu hiện bất thường, nuôi ổn định trong môi trường thí nghiệm 5 ngày, trong lồng kích thước 25 x 35 x 15 cm, cung cấp thức ăn và nước uống đầy đủ.
2.2.4.2. Khảo sát độc tính cấp đường uống
Nguyên tắc: cho chuột thử nghiệm dùng cùng liều mẫu thử trong điều kiện ổn
định như nhau, quan sát các phản ứng xảy ra trong vòng 72 giờ và 14 ngày. Cho 10 chuột nhịn đói ít nhất 12 giờ trước khi cho uống mẫu thử liều duy nhất tối đa có thể qua đường uống, thể tích 50 ml/kg theo tài liệu “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” của Bộ Y tế ban hành theo quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015. Theo dõi và ghi nhận cử động tổng quát, biểu hiện về hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tiêu tiểu và số lượng chết của chuột trong vòng 72 giờ. Nếu sau 72 giờ, chuột không có dấu hiệu bất thường hoặc chết, tiếp tục theo dõi trong vòng 14 ngày. Có 3 trường hợp có thể xảy ra:
- Trường hợp 1: Sau khi chuột uống mẫu thử, số chuột thử nghiệm vẫn bảo toàn, xác định liều của mẫu thử cao nhất có thể qua kim mà không làm chuột chết (Dmax).
- Trường hợp 2: Sau khi cho chuột uống mẫu thử, tỷ lệ chuột tử vong là 100 % thì thử với liều giảm ½ liều đầu. Tiếp tục giảm liều đến khi tìm được liều tối thiểu gây chết 100 % chuột (LD100) và liều tối đa không gây chết chuột (LD0). Tiến hành thử nghiệm xác định LD50.
- Trường hợp 3: Sau khi cho chuột uống mẫu thử, phân xuất tử vong thấp hơn 100 %, không xác định được liều gây chết tuyệt đối, không thể xác định được LD50. Trong trường hợp này có thể xác định liều tối đa không gây chết chuột, gọi là liều dưới liều chết (LD0).
2.2.4.3. Khảo sát độc tính bán trường diễn
Nguyên tắc: Khảo sát độc tính bán trường diễn của mẫu thử bằng cách dựa
vào sự thay đổi chỉ số huyết học, sinh hóa; sự thay đổi về đại thể, vi thể gan, thận giữa lô chứng và lô thử nghiệm sau khi cho chuột uống liều có tác động dược lý trong thời gian dài theo quy định.
Khảo sát độc tính bán trường diễn của mẫu thử trong 14 và 28 ngày theo “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” của Bộ Y tế ban hành theo quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015. Cho chuột thử nghiệm sử dụng liều dự kiến dùng để điều trị cho người và liều cao gấp 3 lần liều điều trị (liều dự kiến sẽ có thể quan sát biểu hiện ngộ độc trên cơ quan của động vật thử nghiệm) trong 14 và 28 ngày, được chăm sóc trong môi trường ổn định như nhau. Thử nghiệm song song với 1 nhóm chứng sinh lý trong cùng điều kiện.
Tính liều thử nghiệm
Liều dự kiến sử dụng của viên hoàn trên người lớn là 5 viên/người 60 kg/ngày. Suy ra, liều thử nghiệm độc tính bán trường diễn trên chuột là 1 viên/kg/ngày (= 5/60 x11,76) và 3 viên/kg/ngày (gấp 3 lần liều dự kiến), trong đó 11,76 là hệ số chuyển đổi liều mg/kg giữa người lớn và chuột theo hướng dẫn của Bộ Y tế.
Do đó, thử nghiệm tiến hành khảo sát độc tính bán trường diễn trên chuột của viên hoàn với liều 1 viên/kg và 3 viên/kg, so sánh với 01 lô chứng sinh lý
ở cùng điều kiện trong thời gian 14 và 28 ngày.
Tiến hành
Chuột (50 % đực, 50 % cái) được nuôi ổn định ở điều kiện thí nghiệm trong 5 ngày, sau đó chia ngẫu nhiên thành 07 lô, mỗi lô 10 con, nuôi riêng lẻ đực, cái. Trong suốt quá trình thử nghiệm, chuột được cung cấp đầy đủ nước uống và thức ăn cám viên với thành phần là bột gạo, đậu nành, ngô và vitamin do Viện vắcxin và Sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp.
Bảng 2.1. Phân lô chuột thử độc tính bán trường diễn của mẫu thử
TT Lô thử nghiệm
Sinh lý trước thí 1
nghiệm
2 Sinh lý sau 14 ngày
(SL14)
Mẫu thử liều 1
3 viên/kg sau 14 ngày
(Thử 1a) Mẫu thử liều 3
4 viên/kg sau 14 ngày
(Thử 2a)
5 Sinh lý sau 28 ngày
(SL28)
Mẫu thử liều 1
6 viên/kg sau 28 ngày
7
Mẫu thử liều 3 viên/kg sau 28 ngày (Thử 2b)
10 (5 đực, 5 cái)
Cho uống mẫu thử liều 3 viên/kg trong 28 ngày liên tục
Cho chuột uống nước cất hoặc mẫu thử mỗi ngày, 01 lần/ngày vào buổi sáng (8 - 10 giờ sáng) liên tục trong 14 ngày (lô SL14, Thử 1a, Thử 2a) hoặc 28 ngày (lô SL28, Thử 1b, Thử 2b), thể tích cho uống 10 ml/kg.
Theo dõi chuột trong quá trình thử nghiệm về: hành vi (tăng đi lại, giảm đi lại, nằm im, run rẩy, co giật…); lông (mượt, dựng đứng, rụng…) và các cơ quan: mắt, mũi…; tình trạng ăn, uống; tính chất phân, nước tiểu, trọng lượng. Sự thay đổi trọng lượng cơ thể của chuột được ghi nhận bằng cách cân chuột 1 lần/tuần.
Sau 14 hoặc 28 ngày, chuột được gây mê bằng đá CO2, mổ nhanh để lấy máu tim thực hiện xét nghiệm các chỉ số huyết học như số lượng hồng cầu (RBC), bạch cầu (WBC), tiểu cầu (PLT), huyết sắc tố hemoglobin (HGB), dung tích hồng cầu hematocrit (HCT), thể tích trung bình một hồng cầu (MCV), số lượng hemoglobin trung bình trong một hồng cầu (MCH), nồng độ hemoglobin trung bình trong một hồng cầu (MCHC) và khoảng phân bố hồng cầu (RDW) (kiểm tra chức năng tạo máu); kiểm tra chức năng gan [aspartat aminotransferase (AST), alanin amino-transferase (ALT), protein toàn phần, bilirubin toàn phần, cholesterol); kiểm tra chức năng thận (ure, creatinin) bằng máy xét nghiệm sinh hóa tự động tại Phòng khám Đa khoa Medlatec, 98 Thích Quảng Đức, Phường 5, Q. Phú Nhuận, TP. Hồ Chí Minh.
Vào ngày 28, quan sát đại thể, ghi nhận màu sắc, tình trạng bề mặt, tổn thương,... các cơ quan tim, gan, thận, phổi, dạ dày, ruột,... Tách lấy gan và thận, rửa sạch bằng nước muối sinh lý lạnh. Thấm khô. Cho gan, thận vào formol 10%. Lấy ngẫu nhiên 6 mẫu gan, thận trong 1 lô để phân tích vi thể sau khi nhuộm hematoxylin-eosin (HE) bằng kính hiển vi quang học (Labomed, Hoa Kỳ) tại Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Quận 2, Thành phố Hồ Chí Minh. Mức độ viêm, tổn thương gan được đánh giá theo thang điểm HAI-Knodell với thang điểm 18 dựa trên mức độ hoại tử quanh khoảng cửa (0-4 điểm); hoại tử quanh
tĩnh mạch trung tâm (0-6 điểm); hoại tử trong tiểu thùy (0-4 điểm); viêm quanh khoảng cửa (0-4 điểm).
Tiêu chí đánh giá
Tình trạng chung, các chỉ số công thức máu, chức năng gan, thận của lô uống mẫu thử khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô sinh lý ở cùng thời điểm khảo sát sau 14 và 28 ngày chứng tỏ việc uống mẫu thử không làm thay đổi tình trạng chung cũng như chức năng tạo máu, chức năng gan, thận của chuột thử nghiệm.