2.2.6.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro
Dòng tế bào RAW264.7 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).
Tế bào đƣợc cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2.
2.2.6.2. Phương pháp MTT
Phƣơng pháp MTT đƣợc sử dụng để đánh giá độc tính của các hợp chất thử nghiệm đối với sự sống sót của tế bào RAW264.7 [89].
Chất thử (20 µl) đƣợc đƣa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ tƣơng tự nồng độ của thí nghiệm NO. Sau khi điều chỉnh để có mật độ tế bào phù hợp, hút
180 µl tế bào vào các giếng của khay 96 giếng đã có chất thử. Trên cùng một đĩa thử, bố trí một số giếng để làm đối chứng không có mẫu thử, chỉ có dung môi pha mẫu là DMSO 10%.
Để đĩa nuôi cấy vào trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2, nuôi trong thời gian 72 giờ. Sau 72 giờ, 10 l MTT (nồng độ cuối cùng là 5 mg/ml) đƣợc cho vào mỗi giếng. Sau 4h, loại bỏ môi trƣờng, tinh thể formazan đƣợc hòa tan bằng 50 L (DMSO) 100%. Giá trị OD đo ở bƣớc sóng 540 nm bằng máy quang phổ.
Lƣợng tế bào sống sót sẽ đƣợc tính theo công thức:
% tế bào sống sót =
2.2.6.3. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO
Phƣơng pháp đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO bằng phƣơng pháp Griess [90].
Tế bào RAW 274.7 đƣợc đƣa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2 x 105 tb/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 37oC và 5% CO2 trong 24h. Tiếp theo, môi trƣờng nuôi cấy đƣợc loại bỏ, thay bằng môi trƣờng DMEM không có FBS trong 3h. Tế bào sau đó đƣợc ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trƣớc khi đƣợc kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1μg/mL) trong 24h. Một số giếng không đƣợc ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu đƣợc coi là đối chứng âm. Trong khi đối chứng dƣơng đƣợc sử dụng là NG-Methyl-L-arginine acetate (L-NMMA) (Sigma) ở các nồng độ 100; 20; 4 và 0.8 μg/ml.
Nitrite (NO2-), đƣợc xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ đƣợc xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Cụ thể là, 100 μL môi trƣờng nuôi tế bào (ủ mẫu) đƣợc chuyển sang đĩa 96 mới và đƣợc thêm vào 100 μL Griess reagent: 50 μL of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) phosphoric acid và 50 μL 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nƣớc. Hỗn
hợp này đƣợc ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lƣợng nitrite sẽ đƣợc đo bằng máy microplate reader ở bƣớc sóng 540 nm. Môi trƣờng DMEM không FBS đƣợc sử dụng nhƣ giếng trắng (blank).
Hàm lƣợng nitrite của từng mẫu thí nghiệm đƣợc xác định nhờ vào đƣờng cong hàm lƣợng chuẩn NaNO2 và đƣợc so sánh % với mẫu chứng âm (LPS).
Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu đƣợc xác định nhờ công thức :
% ức chế =100%- [hàm lƣợng NOsample/hàm lƣợng NOLPS] x 100
Phép thử đƣợc lặp lại 3 lần. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO) đƣợc xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.
2.2.7. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng sinh
Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các dịch chiết và các hợp chất phân lập đƣợc đánh giá đối với các vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ), bao gồm ba chủng vi khuẩn Gram dƣơng (Enterococcus faecalis ATCC299212, Staphylococcus aureus
ATCC25923 và Bacillus cereus ATCC13245), ba chủng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, và Salmonella enterica ATCC13076), và một chủng nấm men Candida albicans ATCC 24433.
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đƣợc thực hiện dựa trên phƣơng pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phƣơng pháp thử hoạt tính kháng VSVKĐ và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu). Mẫu ban đầu đƣợc pha loãng trong DMSO
ở dải nồng độ giảm dần từ 300−2.34 µM với số thí nghiệm lặp lại N=3. Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 2×105CFU/ml.
Tiến hành thử: lấy 6 µl dung dịch mẫu thử có nồng độ 10mM vào hàng đầu tiên có chứa 100µl môi trƣờng LB rồi pha loãng nối tiếp giảm ½ nồng độ vào các hàng có chứa 50µl cho đến khi đạt đƣợc nồng độ là 2.34 µM, thêm 50 µl dung dịch vi khuẩn và nấm ở nồng độ 2×105 CFU/ml, ủ ở 37oC. Sau 24h, xác định sơ bộ giá trị MIC bằng quan sát. Giá trị MIC đƣợc xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật sau 24 giờ nuôi cấy và đƣợc xác định chính xác dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ Bioteck và phần mềm Raw data. Streptomycin và nystatin đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng [91, 92].
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nhân sinh khối lƣợng lớn và tạo cao chiết tổng chủng Aspergillus
niger IMBC-NMTP01
Chủng A. niger IMBC-NMTP01 đƣợc lên men nhân sinh khối trong 50 bình tam giác 2 L, mỗi bình chứa 150 mL môi trƣờng PDA trong 25 ngày ở nhiệt độ phòng (Hình 3.1).
Hình 3.1. Lên men nhân sinh khối lƣợng lớn mẫu IMBC-NMTP01
Sinh khối và sợi nấm đƣợc đƣợc ngâm chiết với EtOAc (1L x 3 lần) trong điều kiện siêu âm (30 phút/ lần) ở nhiệt độ phòng (Hình 3.2). Dịch chiết đƣợc gộp lại, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc 5.2 g cao chiết.
3.2. Kết quả phân lập, làm sạch, tinh chế các hợp chất từ các chủng nấm mốc
A. niger IMBC-NMTP01
Chủng nấm mốc A. niger IMBC-NMTP01 sau khi đƣợc lên men sinh khối lƣợng lớn và chiết với ethylacetate thu đƣợc 5.2 g cao chiết tổng. Cao chiết này đƣợc cắt phân đoạn qua cột pha đảo (RP) C18, rửa giải gradient lần lƣợt với các tỷ lệ dung môi tăng dần của methanol (MeOH) trong H2O từ 20:80 đến 100: 0 để thu đƣợc sáu phân đoạn F1 - F6. Phân đoạn F1 đƣợc tách bằng sắc ký cột Sephadex LH-20 (CC), sử dụng MeOH-H2O (4: 1, v/v) làm chất rửa giải để thu đƣợc hợp chất A14 (18 mg). Phân đoạn F2 đƣợc rửa nhiều lần bằng MeOH và lọc qua giấy lọc, thu đƣợc chất bột màu trắng (hợp chất A10, 11 mg) và ba phần nhỏ (F2.1 - F2.3). F2.1 đƣợc tách bằng silica gel CC, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (7: 1, v/v) và đƣợc tinh chế thêm qua cột RP C18 HPLC, sử dụng hệ dung môi rửa giải 11% CH3CN trong nƣớc (chứa 0,1% HCOOH) để tạo ra hợp chất A3
(2,2 mg, tR = 28,2 phút). F2.2 đƣợc đƣa vào silica gel CC, với hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (7: 1, v/v) làm chất rửa giải thu đƣợc hợp chất A4 (3 mg). Phân đoạn F3 đƣợc đƣa lên cột Sephadex LH-20 CC, rửa giải bằng MeOH-H2O (4: 1, v/v) để tạo ra sáu phần F3.1 – F3.6. F3.1 đƣợc sắc ký bằng cột silica gel, với hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (8: 1, v/v) làm pha động để thu đƣợc hợp chất A5 (5 mg). F3.2 đƣợc tách bằng cột silica gel CC, sử dụng hệ n-hexan – EtOAc (1: 2,5, v/v) làm pha động để thu đƣợc hợp chất A2 (13 mg). F3.3 đƣợc sắc ký trên silica gel, rửa giải bằng n-hexan-EtOAc (1: 1, v/v) để thu đƣợc hợp chất A1 (2,4 mg) và một phần nhỏ đƣợc tinh chế thêm qua cột RP C18 HPLC, sử dụng dung môi 28% CH3CN trong nƣớc (chứa 0,1% HCOOH) làm chất rửa giải để giải phóng hợp chất A11 (2 mg, tR = 28,3 phút). Từ phân đoạn F3.5, hợp chất A8 (6 mg) đƣợc phân lập bằng cột silica gel CC, rửa giải bằng CH2Cl2 – EtOAc (4: 1, v/v). Phân đoạn F4 đƣợc tách qua cột Sephadex LH-20, sử dụng hệ dung môi MeOH – H2O (4: 1, v/v) làm chất rửa giải để tách thành 5 phần F4.1 – F4.5. F4.2 đƣợc sắc ký qua cột silica gel CC, rửa giải bằng CH2Cl2 – EtOAc (3,5: 1, v/v) và đƣợc tinh chế thêm qua hệ thống RP C18 HPLC, sử dụng hệ rửa giải 36% CH3CN trong H2O (chứa 0,1% HCOOH) thu đƣợc hợp chất A12 (4 mg, tR = 17,0 phút). F4.3 đƣợc tách bằng silica gel CC, rửa giải với CH2Cl2 – acetone (8: 1, v/v) để thu đƣợc hợp chất A7 (16 mg) và một phân đoạn nhỏ đƣợc tinh chế thêm qua hệ thống RP C18 HPLC, sử dụng 33% CH3CN trong H2O (chứa 0,1% HCOOH) làm chất rửa giải để thu đƣợc hợp chất A9 (2,3 mg, tR = 28,7 phút). F4.4 đƣợc đƣa qua cột RP C18 CC, rửa giải bằng CH3CN – H2O (1: 1, v/v) để tạo ra các phân đoạn con F4.4.1 – F4.4.4. F4.4.1 đƣợc tinh chế qua RP C18 HPLC, sử dụng hệ rửa
giải 47% CH3CN trong H2O (chứa 0,1% HCOOH) thu đƣợc hợp chất A6 (6 mg, tR = 31,8 phút). Tƣơng tự, hợp chất A13 (5 mg, tR = 30,6 phút) thu đƣợc từ phân đoạn F4.4.4 bằng cách chuẩn bị RP C18 HPLC, sử dụng hệ dung môi 45% CH3CN trong H2O (chứa 0,1% HCOOH). Nhƣ vậy, từ cao chiết tổng của chủng A. niger IMBC- NMTP01, sử dụng các phƣơng pháp sắc ký kết hợp, kết quả thu đƣợc 14 hợp chất sạch (Hình 3.3).
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ chủng nấm mốc A. niger IMBC-NMTP01
3.3. Kết quả xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
Từ cao chiết tổng của chủng nấm A. niger IMBC-NMTP01, 14 hợp chất đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc hóa học, trong đó có hai hợp chất mới (A1 và A3)
12 hợp chất đã biết (A2, A4–A12). Cấu trúc của các hợp chất đƣợc xác định thông qua phân tích phổ NMR 1 chiều và 2 chiều và phổ MS, kết hợp với so sánh các số liệu của các hợp chất đã công bố.
3.3.1. Hợp chất A1: epi-Aspergillusol (chất mới)
Hợp chất A1 phân lập đƣợc có dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử là C14H14O4, đƣợc xác định dựa trên pic ion phân tử tại m/z 247.0963 [M+H]+ trên phổ HRESITOFMS, tƣơng ứng với 8 độ bất bão hòa.
Hình 3.4. Cấu trúc và tƣơng tác HMBC (→ và COSY (—) của hợp chất A1
Trên phổ 1H NMR (đo trong CDCl3) của hợp chất A1 xuất hiện các tín hiệu của 5 proton thơm tại δH 7.22 (d, J = 8.0 Hz, H-9 and H-13), 7.32 (t, J = 8.0 Hz, H-10 and H- 12), và 7.26 (t, J = 8.0 Hz, H-11), đặc trƣng cho sự có mặt của một vòng phenyl. Phổ 1H- NMR cũng thể hiện tín hiệu của hai proton olefinic tại δH 5.44 (d, J = 2.5 Hz, H-2) và 6.05 (dd, J = 1.0, 2.5 Hz, H-4), một proton oxymethine tại δH 4.60 (dd, J = 4.0, 8.0 Hz, H-6), hai proton bắt cặp germinal tại δH 3.26 (dd, J = 4.0, 14.0 Hz, Ha-7) và
2.93 (dd, J = 8.0, 14.0 Hz, Hb-7), và một nhóm methoxy tại δH 3.84 (s, 3-OCH3). Từ những dữ liệu 1H NMR quan sát đƣợc, kết hợp với phân tích phổ 13C-NMR và HSQC (trong CDCl3) gợi ý sự hiện diện của phần cấu trúc 3-methoxy-1-oxo-1H-pyran-5-yl trong phân tử. Điều này đƣợc thể hiện thông qua sự xuất hiện của của một carbonyl carbon tại δC 164.2 (C-1), bốn sp2 carbons tại δC 88.2 (C-2), 171.3 (C-3), 99.0 (C-4), và 165.2 (C-5). Vị trí của nhóm metoxy tại C-3 đƣợc xác nhận bởi tƣơng tác HMBC từ proton của nó (δH 3.84) với C-3. Ngoài ra, tƣơng tác COSY giữa H-6 và H2-7, cùng với tƣơng tác HMBC từ H2-7 với C-8, C-9 và C-13 cho thấy sự xuất hiện của một đơn vị 1-hydroxy-2-phenylethyl. Cuối cùng, cấu trúc phẳng của hợp chất A1 đƣợc xác định là 5-(6-hydroxy-7-phenylethyl)-3-methoxy-1H-pyran-1-one bởi tƣơng tác HMBC từ H-6 đến C-4 và C-5 . So sánh dữ liệu 1H- và 13C-NMR của hợp chất A1 với hợp chất aspergillusol đã biết cho thấy 2 hợp chất có cấu trúc phẳng giống nhau [93]. Tuy nhiên, giá trị góc quay cực của hợp chất A1 và aspergillusol lại ngƣợc chiều nhau [hợp chất
A1: = -61.0 (c = 0.5, CHCl3) so với aspergillusol: = +35 (c = 0.4, CHCl3)], gợi ý rằng hợp chất A1 là đồng phân đối quang của aspergillusol [93]. Trên cơ sở đó, cấu hình tuyệt đối của hợp chất A1 đƣợc xác định bẳng phƣơng pháp tính toán phổ lƣỡng sắc tròn điện tử (ECD) bằng chƣơng trình Gaussian 16W. Đầu tiên, các cấu dạng của cặp đồng phân 6R và 6S đƣợc phân tích bằng chƣơng trình Spartan'18 (MMFF).
Các cấu dạng đƣợc lựa chọn đƣợc tối ƣu hóa thông qua hàm tính toán B3LYP/6-31+ +G(d,p) và conductor-like polarizable continuum model (CPCM) trong dung môi methanol [86]. Tiếp theo, phổ ECD của các cấu dạng đƣợc tính toán sử dụng TDDFT với hàm chức năng tƣơng tự. Cuối cùng, phổ ECD tính toán của các cấu hình đƣợc mô phỏng bằng công cụ SpecDis 1.71 [87, 94]. Nhƣ thể hiện trong hình 3.5, phổ ECD tính toán cho đồng phân 6S cho thấy sự phù hợp với dữ liệu phổ ECD thực nghiệm, trong khi phổ ECD tính toán cho cấu hình 6R cho kết quả đối xứng hoàn toàn. Điều này cho phép khẳng định cấu hình tuyệt đối của vị trí C-6 của hợp chất A1 là S. Trên cơ sở các phân tích phổ nêu trên, cấu trúc của hợp chất A1 đƣợc xác định là epi-aspergillusol.
Hình 3.5. Phổ ECD tính toán lý thuyết và thực nghiệm của hợp chất A1 Hằng số hóa lý của hợp chất epi-Aspergillusol (A1): bột màu trắng vô định hình. Công thức phân tử: C14H14O4. = –61.0 (c = 0.5, CHCl3). HRESITOFMS: m/z
247.0963 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C14H15O4+, 247.0965). ECD (MeOH) mdeg (λmax): −2.13 (283), +0.97 (234), −2.67 (219), +2.09 (205) nm. 1H NMR (CDCl3 và CD3OD, 500 MHz) và 13C NMR (CDCl3 và CD3OD, 125 MHz): trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A1 Vị trí δCa,b 1 164.2 2 88.2 3 171.3 4 99.0 5 165.2 6 71.3 7 41.6 8 136.2 9 129.5 10 128.8 11 127.1 12 128.8 13 129.5 3- 56.0 OCH3 aĐo trong CDCl3, b 125 MHz, c 500 MHz, d CD3OD H ìn h 3. 6. P h ổ H R E SI M
c ủ a
A 1
Hình 3.7. Phổ 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) của A1
Hình 3.9. Phổ HSQC (CDCl3, 500 MHz) của A1
Hình 3.11. Phổ 1H NMR (CD3OD, 500 MHz) của A1
Hình 3.13. Phổ HSQC (CD3OD, 500 MHz) của A1
Hình 3.15. Phổ COSY (CD3OD, 500 MHz) của A1 3.3.2. Hợp chất A3: Aspernigin (chất mới)
Hình 3.16. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC (→), COSY (—) của hợp chất A3
Hợp chất A3 có dạng chất bột màu trắng vô định hình. Công thức phân tử của hợp chất A3 đƣợc dự đoán là C13H17NO7, thông qua các ion giả phân tử tại m/z
334.0692 [M+Cl]- và m/z 298.0917 [M-H]- trên phổ HRESITOFMS. Trên phổ 1H NMR (đo trong DMSO-d6) ghi nhận tín đặc trƣng của vòng benzene thế para tại δH
7.03 (br d, J = 8.5 Hz, H-5′ và H-9′) và 6.66 (br d, J = 8.5 Hz, H-6′ and H-8′). Trên phổ
1
H NMR cũng ghi nhận hai cặp proton germinal tại δH 4.30 (dd, J = 3.0, 11.5 Hz, Ha-1), 4.10 (dd, J = 7.0, 11.5 Hz, Hb-1), 3.55 (dd, J = 3.5, 11.0 Hz, Ha-4), và 3.39 (dd, J = 5.5, 11.0 Hz, Hb-4), hai proton oxymethine tại δH 3.62 (m, H-2) và 3.40 (m, H-3), và một nhóm methylene tại δH 3.72 (H2-3′). Phân tích phổ 13C NMR và HSQC (trong
DMSO-d6) cho thấy các tín hiệu của một carbonyl carbon tại δC 163.9 (C-1′), bảy sp2 carbon bao gồm sáu tín hiệu của vòng benzene thế para tại δC 126.5 (C-4′), 129.7 (C-5′ và C-9′), 115.0 (C-6′ và C-8′), và 155.7 (C-7′) và một carbon không proton mang nitơ tại δC 150.1 (C-2′), và một nhóm methylene tại δC 29.2 (C-3′). Trên phổ HMBC, tín hiệu proton tại δH 3.72 thể hiện tƣơng tác với C-1′, C-2′, C-5′, và C-6′, gợi ý sự có mặt của một đơn vị tyrosine oxime trong phân tử [95, 96]. Phổ 13C NMR cũng ghi nhận các tín hiệu đặc trƣng của phần cấu trúc butane-1,2,3,4-tetraol tại δC 67.1 (C-1), 69.3 (C-2), 72.1 (C-3), và 62.9 (C-4). Điều này đƣợc củng cố thông qua các tƣơng tác HMBC từ các tín hiệu proton oxymethylene tại δH 4.30/4.10 (H2-1) và δH 3.55/3.39 (H2-4) với C-
2 và C-3, cùng với tƣơng tác COSY giữa H2-1/H-2/H-3/H2-4 (Hình 3.6). Sự kết nối của
2 đơn vị butane-1,2,3,4-tetraol và tyrosine oxime thông qua cầu liên kết ester đƣợc khẳng định thông qua tƣơng tác HMBC từ H2-1 đến C-1′. Tiến hành so sánh dữ liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A3 với aspergillusol A cho thấy hai hợp chất có cấu trúc tƣơng tự, ngoại trừ sự vắng mặt của đơn vị oxime axit 4-hydroxyphenylpyruvic ở hợp chất A3 so với cấu trúc đối xứng của aspergillusol A [95]. Cấu hình tƣơng đối của hợp chất A3 đƣợc đề xuất dựa trên phân tích dữ liệu 1H và 13C NMR của A3 so với các cấu hình tƣơng tự đã biết. Độ dịch chuyển hóa học carbon các vị trí C-2′ (δC
150.1) và C-3′ (δC 29.2) của hợp chất A3 gần tƣơng tự với các vị trí của aspergillusol A [δC 150.5 (C-2′) and 29.6 (C-3′)] [95] và 2-(hydroxyimino)-phenylpropanoic acid [δC 150.13 (C-2′) và 29.85 (C-3′)] cũng nhƣ propanoic 2-(hydroxyimino)-3-(4- hydroxyphenyl) acid [96], cho thấy nhóm chức oxime của hợp chất A3 có cấu hình dạng Z. Tƣơng tự, phổ 1H và 13C NMR của phần cấu trúc butane-1,2,3,4-tetraol của A3
cho thấy sự phù hợp với các hợp chất (+)-erythrin and (+)-montagnetol đã biết [97, 98], qua đó khẳng định rằng hai nhóm hydroxy ở C-2 và C-3 có mối quan hệ erythro với nhau. Điều này đƣợc khẳng định thêm bởi hằng số bắt cặp khá nhỏ (J = 3.0 Hz) giữa H-2 và H-3