Bằng các phƣơng pháp phân tích phổ, cấu trúc hóa học của 14 hợp chất phân lập từ chủng nấm mốc A. niger IMBC-NMTP01 đã đƣợc xác định là: epi-aspergillusol (A1), pyrophen (A2) [69], aspernigin (A3), 2-(hydroxyimino)-3-(4- hydroxyphenyl)propanoic acid (A4) [96], aspergillusol A (A5) [95], rubrofusarin B (A6) [101], nigerasperone A (A7) [81], fonsecin (A8) [102], TMC-256C1 (A9) [49], pyranonigrin A (A10) [103], orlandin (A11) [104], nigerasperone C (A12) [81], asperpyrone A (A13) [105], and 5-(hydroxymethyl)-2-furancarboxylic acid (A14) [107] (Hình 3.42).
Hình 3.42. Cấu trúc hóa học của các hợp chất A1-A14 3.4. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất
Các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng nấm mốc A. niger IMBC-NMTP01 đƣợc đánh giá hoạt tính gây độc tế bào đối với sáu dòng tế bào ung thƣ biểu mô ở ngƣời, bao gồm: HepG2, KB, HL-60, MCF-7, SK-Mel-2 và LNCaP bằng phƣơng pháp sulforhodamine B (SRB). Kết quả là, trong số các naphtho-γ-pyrones (A6-A9), hợp chất A9 có độc tính tế bào mạnh nhất đối với tất cả các dòng tế bào, với giá trị IC50
nằm trong khoảng từ 9.1 đến 23.5 µM, trong khi hợp chất A6 (rubrofusarin B) chỉ gây độc tế bào đối với hai dòng tế bào HepG2 và MCF-7, với giá trị IC50 lần lƣợt là 77.1 và 68.3 µM (Bảng 3.15). Theo nghiên cứu của Song Y.C và cộng sự, rubrofusarin B có nguồn gốc từ chủng Aspergillus niger IFB-E003 đƣợc chứng minh là gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thƣ ruột kết SW1116 với giá trị IC50 là 4,5 µg/mL) [51].
Cả hai naphthopyrones dimeric là nigerasperone C (A12) và asperpyrone A (A13) và dẫn xuất acid furancarboxylic (A14) đều thể hiện độc tính tế bào vừa phải đối với tất cả các dòng tế bào ung thƣ biểu mô trên, với giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 47.7 đến 84.5 µM. Asperpyrone A là một hợp chất tự nhiên đƣợc phân lập từ
Aspergillus niger với các hoạt tính sinh học khác nhau là kháng u, kháng khuẩn và chống oxy hóa. Nghiên cứu của Xu K. và cộng sự 2019 đã chỉ ra rằng asperpyrone A đƣợc phân lập từ chủng Aspergillus sp. XNM-4 có độc tính tế bào mạnh trên năm dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời (PANC-1, A549, MDA-MB-231, Caco-2 và SK-OV-3) và một dòng tế bào bình thƣờng ở ngƣời (HL-7702) [108].
Bảng 3.15. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất A1-A14 Hợp chất A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7
A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 Ellipticinec
aGiá trị ± SD (n = 3); b Không có hoạt tính (> 100 µM); c Đối chứng dƣơng
Trong số hai phenethyl-α-pyrones (A1 và A2), hợp chất A1 thể hiện độc tính tế bào vừa phải đối với các dòng tế bào HepG2, KB và MCF-7, với các giá trị IC50 tƣơng ứng là 52.0, 91.2 và 65.0 µM, trong khi chất tƣơng tự (hợp chất A2), với nhóm chức acetamide ở C-6, không gây độc các dòng tế bào trên ở các nồng độ đƣợc thử nghiệm. Khả năng gây độc ở mức trung bình của ba chất chuyển hóa hydroxyimine (A3–A5) đã đƣợc quan sát thấy đối với năm dòng tế bào ung thƣ, ngoại trừ HepG2, với giá trị IC50
trong khoảng 58.7 đến 88.9 µM. Hợp chất A11 có hoạt tính yếu đối với dòng tế bào MCF-7 và SK-Mel-2, với giá trị IC50 tƣơng ứng là 91.5 và 83.8 µM.
Đáng chú ý, đây là lần đầu tiên nghiên cứu đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất A4, A5, A9, và A11, trong đó, hợp chất A9 có hoạt tính tốt, ức chế sự phát triển của 6 dòng tế bào ung thƣ nghiên cứu, điều này mở ra tiềm năng phát triển cho các nghiên cứu sâu rộng hơn đối với hợp chất này.
3.5. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế NO của các hợp chất
Khả năng ức chế NO định hƣớng kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập đƣợc đánh giá thông qua việc ức chế sản xuất quá mức NO trong các tế bào RAW264.7 đƣợc kích thích bởi LPS. Kết quả cho thấy, ngoại trừ hợp chất A2 và A13, tất cả các hợp chất đƣợc thử nghiệm đều ức chế sản sinh NO phụ thuộc vào liều lƣợng, với giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 2.1 đến 84.4 µM (bảng 3.16). Đáng chú ý, tác dụng ức chế NO của hợp chất A9 (TMC-256C1) với giá trị IC50 = 2.1 µM mạnh hơn so với đối chứng dƣơng, L-NMMA (IC50 = 7.6 µM). Trƣớc đó, hợp chất TMC-256C1 phân lập từ chủng
Aspergillus niger var niger TC 1629 đƣợc xác định là chất ức chế dẫn truyền tín hiệu IL-4 [49]. Nghiên cứu của Kim và cộng sự năm 2016 đã chỉ ra rằng
TMC-256C1 từ chủng Aspergillus sp. SF-6354 có hoạt tính bảo vệ chống lại độc tính tế bào do glutamate gây ra trong tế bào HT22. TMC-256C1 còn thể hiện tác dụng chống viêm thần kinh trong các tế bào vi mô BV2 đƣợc tạo ra bởi lipopolysaccharides (LPS). TMC-256C1 còn ngăn chặn sự sản xuất các chất trung gian gây viêm là NO và PGE2 do LPS gây ra thông qua việc ức chế biểu hiện protein iNOS và COX-2 [109].
Nigerasperone A (hợp chất A7) cho thấy tác dụng ức chế NO đáng kể (IC50 = 7.4 M) tƣơng đƣơng với tác dụng của L-NMMA. Điều thú vị là tác dụng ức chế NO của rubrofusarin B (hợp chất A6) (IC50 = 84.4 µM) có nhóm metyl ở C-3 thấp hơn đáng kể so với tác dụng của chất tƣơng tự hydroxyl hóa của nó (hợp chất A7). Các hợp chất A1, A4, A10, A12 và A14 ức chế đáng kể sự sản sinh NO, với giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 14.5 đến 24.0 µM, trong khi các hợp chất A3, A5 và A11 thể hiện tác dụng ức chế trung bình, với giá trị IC50 trong khoảng 41.3 đến 56.0 µM.
Đây là lần đầu tiên nghiên cứu hoạt tính ức chế NO của các hợp chất A2, A4- A8, và A10-A12, trong đó hợp chất A7 (nigerasperone A) có hoạt tính ức chế NO định hƣớng kháng viêm rất tốt.
Bảng 3.16. Hoạt tính ức chế NO của các hợp chất A1-A14 Hợp chất
3.6. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các hợp chất
Các hợp chất A1–A14 phân lập từ chủng nấm mốc A. niger IMBC-NMTP01 đƣợc thử nghiệm hoạt tính kháng sinh đối với các vi sinh vật kiểm định, bao gồm vi khuẩn Gram dƣơng (Enterococcus faecalis ATCC299212, Staphylococcus aureus ATCC25923 và
Bacillus cereus ATCC13245), ba chủng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC25922,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, và Salmonella enterica ATCC13076), và một chủng nấm men Candida albicans ATCC 24433. Kết quả cho thấy tất cả các hợp chất ức chế đáng kể sự phát triển của vi khuẩn Gram dƣơng
E. faecalis, với giá trị MIC là 32 hoặc 64 µM, tuy nhiên không có sự ức chế nào đƣợc ghi nhận đối với năm chủng vi khuẩn còn lại (Bảng 2.2.1). Ngoài ra, tất cả các hợp chất, ngoại trừ hợp chất A10, thể hiện hoạt tính ức chế sự sinh trƣởng của nấm men
Candida albicans, với giá trị MIC từ 64-128 µM.
Trong nghiên cứu này, hợp chất A6 (rubrofusarin B) ức chế sự phát triển của vi khuẩn E.faecalis và chủng nấm men C.albican. Trƣớc đó, nghiên cứu của Song Y.C và cộng sự đã chỉ ra rằng rubrofusarin B có nguồn gốc từ chủng Aspergillus niger IFB- E003 thể hiện sự ức chế tăng trƣởng so với năm dòng vi sinh vật bao gồm 3 chủng vi khuẩn (B. subtilis, E. coli, P. fluorescence) và 2 chủng nấm 1 (T. rubrum và C. albicans) với giá trị MIC trong khoảng từ 1,9 đến 31,2 µg/mL [51].
Đáng chú ý, đây là lần đầu tiên hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất A4, A5,
A7, A9, A11 và A12 đƣợc nghiên cứu.
Bảng 2.2.1. Tác dụng kháng sinh của các hợp chất A1-A14
Hợp chất
A1 A2 A3
A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 Streptomycin* Nystatin*
EF: E. faecalis ATCC299212; SA: S. aureus ATCC25923; BC: B. cereus
ATCC13245; EC: E. coli ATCC25922; PA: P. aeruginosa ATCC 9027; SE: S. enterica ATCC13076; CA: C. albicans ATCC 24433;* Đối chứng dƣơng; (-): không có hoạt tính.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
- Đã tạo đƣợc 5.2 g cao chiết tổng từ sinh khối lên men của chủng nấm mốc
Aspergillus niger IMBC-NMTP01 phân lập từ hạt lạc.
- Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 14 hợp chất bao gồm 2 hợp chất mới epi-aspergillusol (A1) và aspernigin (A3), và 12 hợp chất đã biết: pyrophen (A2), 2-(hydroxyimino)-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid (A4), aspergillusol A (A5), rubrofusarin B (A6), nigerasperone A (A7), fonsecin (A8), TMC-256C1 (A9), pyranonigrin A (A10), orlandin (A11), nigerasperone C (A12), asperpyrone A (A13), và 5-(hydroxymethyl)-2-furancarboxylic acid (A14) từ cao chiết tổng của chủng nấm mốc Aspergillus niger IMBC-NMTP01.
- Các hợp chất A9, A12–A14 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với tất cả các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm HepG2, KB, HL-60, 7MCF-7, SK-Mel2 và LNCaP (IC50 = 9.1–83.4 µM). Các hợp chất A3-A5 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với năm dòng tế bào KB, HL-60, MCF-7, SK-Mel2 và LNCaP (IC50 = 58.7–89.2 µM). Hợp chất A1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào HepG2, KB và MCF-7 (IC50 = 52.0–91.2 µM).
- Các hợp chất A1, A3–A12 thể hiện hoạt tính ức chế sản sinh quá mức NO ở tế bào RAW264.7 kích thích bởi LPS (IC50 = 2.1–84.4 µM).
- Tất cả các hợp chất A1–A14 đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với E. faecalis (MIC = 32–64 µM). Các hợp chất A1–A9, A10–A14 thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của nấm men C. albicans (MIC = 64–128 µM).
Kiến nghị
Cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động ở cấp độ phân tử của các hợp chất có hoạt tính sinh học phát hiện từ chủng Aspergillus niger IMBC-NMTP01.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
Tran Hong Quang, Nguyen Viet Phong, Le Ngoc Anh, Tran Thi Hong Hanh, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Thi Thanh Ngan, Nguyen Quang Trung, Nguyen Hoai Nam & Chau Van Minh (2020): Secondary metabolites from a peanut-associated fungus
Aspergillus niger IMBC-NMTP01 with cytotoxic, anti-inflammatory, and
antimicrobial activities, Natural Product Research, DOI:
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Aly A.H., Debbab A., Proksch P., 2011, Fifty years of drug discovery from fungi, Fungal Diversity, 50(1), pp. 3–19.
2. Bugni T.S, Ireland C.M, 2004, Marine-derived fungi: a chemically and biologically diverse group of microorganisms, Nat. Prod. Rep., 21, pp. 143-163.
3. Konig G.M, Kehraus S., Seibert S.F., Abdel-Lateff A., Muller D., 2006, Natural products from marine organisms and their associated microbes, Chembiochem, 7, pp. 229-238.
4. Rateb M.E., Ebel R., 2011, Secondary metabolites of fungi from marine habitats, Nat. Prod. Rep., 28, pp. 290-344.
5. Xu L., Meng W., Cao C., Wang J., Shan W., Wang Q., 2015, Antibacterial and antifungal compounds from marine fungi, Marine drugs, 13(6), pp. 3479-3513.
6. Holten K.B., Onusko E.M., 2000, Appropriate prescribing of oral betalactam antibiotics, Am Fam Physician, 62, pp. 611–620.
7. Grove J.F., MacMillan J., Mulholland T.P.C., Rogers M.A.T., 1952, Griseofulvin, Part IV, Structure, J Chem Soc, pp. 3977–3987.
8. Godtfredsen W.O., Jahnsen S., Lorck H., Roholt K., Tybring L., 1962, Fusidic acid; a new antibiotic, Nat., pp. 193-987.
9. Butler M.S., 2004, The role of natural product chemistry in drug discovery, J Nat. Prod, 67, pp. 2141-2153.
10. Abramovits W., Gupta A., Gover M., 2007, Altabax (reptamulin ointment) 1%,
Skinmed, 6, pp. 239-240.
11. Dewick P.M., 2006, Medicinal Natural Products, A Biosynthesis Approach, John Wiley & Sons Ltd., Baffins Lane, Chichester, UK.
12. Gewirtz D., 1999, A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin, Biochem. Pharmacol, 57(7), pp. 727-741.
13. Wang D., Wang S., Liu Q., Wang M., Wang C., Yang H., 2013, SZ-685C exhibits potent anticancer activity in both radiosensitive and radioresistant NPC cells through the miR-205-PTEN-Akt pathway, Oncol. Rep, 29(6), pp. 2341- 2347.
14. Liu S., Yan X., Yu M., Chen J., Zhang L., 2010, A novel compound from
15. Abraham E.P., Chain E., Fletcher C.M., Gardner A.D., Heatley N.G., Jennings M.A., Florey H.W., 1941, Further observations on penicillin, Lancet, 238, pp 177–189.
16. Newton G.G.F., Abraham E.P., 1955, Cephalosporin C, a new antibiotic containing sulphur and D-α-aminoadipic acid, Nature, pp 175-548
17. Elander R.P., 2003, Industrial production of β-lactam antibiotics, Appl Microbiol Biotechnol, 61, pp 385–392.
18. Shaw L.M., 1989, Advances in cyclosporine pharmacology, measurement, and therapeutic monitoring, Clin Chem, 35, pp 1299–1308
19. Smith D., Ryan M.J., 2009, Fungal sources for new drug discovery, AccessScience, ©McGraw-Hill Companies.
20. Endo A., Kuroda M., Tsujita Y., 1976, ML-236A, ML-236B, and ML236C, new inhibitors of cholesterogenesis produced by Penicillium citrinium, J Antibiot, 29, pp 1346–1348.
21. Negishi S., Cai-Huang Z., Hasumi K., Murakawa S., Endo A., 1986, Productivity of molacolin K (mevilonin) in the genus Monascus, Hakko Kogaku Kaishi, 64, pp 509–512.
22. Anke T., Oberwinkler F., Steglich W., Schramm G., 1977, The strobilurins - new antifungal antibiotics from the basidiomycete Strobilurus tenacellus, J Antibiot, 30, pp 806–810.
23. von Benz F., Knusel F., Nuesch J., Treichler H., Voser W., Nyfeler R., Keller- Schierlein W., 1974, Echinocandin B, ein neuartiges polipeptide-antibiotikum aus Aspergillus nidulans var. echinatus: Isolierung und Bausteine, Helv Chim Acta, 57, pp 2459–2477.
24. Sasaki T., Takagi M., Yaguchi T., Miyadoh S., Okada T., Koyama M., 1992, A new anthelmintic cyclodepsipeptide, PF1022A, J Antibiot, 45, pp 692–697.
25. Ondeyka J.G., Helms G.L., Hensens O.D., Goetz M.A., Zink D.L., Tsipouras A., Shoop W.L., Slayton L., Dombrowski A.W., Polishook J.D., Ostlind D.A., Tsou N.N., Ball R.G., Singh S.B., 1997, Nodulisporic acid A, a novel and potent insecticide from a Nodulisporium sp. isolation, structure determination, and chemical transformations, J Am Chem Soc, 119, pp 8809–8816.
26. Reddy K., Farhana N., Wardah A., Salleh B., 2010, Colonizing Rice Grains in South Asia, Pak. J. Biol. Sci., 13(16), pp 794-801.
27. Klick M., 2002, Identification of Common Aspergillus species, Netherlands:Centraalbureau voor Schimmelautures.
28. Baker S.E., 2006, Aspergillus niger genomics: past, present and into the future, Medical mycology, 44, pp 17-21.
29. Krijgsheld P., Bleichrodt R., van Veluw G.J., Wang F., Müller W.H., Dijksterhuis J., Wösten H.A.B., 2013, Development in Aspergillus, Studies in Mycology, 74, pp 1–29.
30. Sugui J.A., Kwon-Chung K.J., Juvvadi P.R., Latge J.P., Steinbach W.J., 2015,
Aspergillus fumigatus and related species, Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 5(2), pp a019786–a019786.
31. Meyer V., Fiedler M., Nitsche B., King R., 2015, The Cell Factory Aspergillus
Enters the Big Data Era: Opportunities and Challenges for Optimising Product Formation, Filaments in Bioprocesses, pp 91–132.
32. Rippel-Baldes A., 1955, Grundzüge der Mikrobiologie, 3rd edn. Springer, Berlin Heidelberg New York.
33. Toghueo R.M.K., Sahal D., Zabalgogeazcoa Í., Baker B., Boyom F.F., 2018, Conditioned media and Organic Elicitors Underpin the Production of Potent Antiplasmodial Metabolites by Endophytic Fungi from Cameroonian Medicinal Plants, Parasitol. Res., 117(8), pp 2473–2485.
34. Schuster E., Dunn-Coleman N., Frisvad J.C., Van Dijck P.W., 2002, On the safety of Aspergillus niger – a review, Appl Microbiol Biotechnol, 59, pp 426– 435.
35. Pel H.J., de Winde J.H, Archer D.B, Dyer P.S., Hofmann G., Schaap P.J., Turner G.; de Vries R.P., Albang R., Albermann K., 2007, Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88, Nat Biotechnol, 25(2), pp 221–231.
36. Frost G.M., Moss D.A., 1987, Production of enzymes by fermentation, In: Rehm HJ, Reed G (eds) Biotechnology, vol 7a. VCH, Weinheim, pp 65–102.
37. Grassin C., Fauguenbergue P., 1999, Enzymes, fruit juice processing, Flickinger MC, Drew SW (eds) Encyclopedia of bioprocess technology: fermentation, biocatalysis, and bioseparation, Wiley & Sons, Inc, New York
38. Duarte J.C., Costaferreira M., 1994, Aspergilli and Lignocellulosics - Enzymology and Biotechnological Applications, FEMS Microbiol. Rev., 13 (2- 3), pp 377–386.
39. Berka R.M., Dunn-Coleman N.S., Ward M., 1992, Industrial enzymes from Aspergilli, Bennett JW, Klich MA (eds) Aspergillus, biology and industrial applications, Butterworth-Heinemann, London, pp 155–202.
40. Cynthia Z.B., 2004, Production of toxic metabolites in Aspergillus niger,
Aspergillus oryzae, and Trichoderma reesei: justification of mycotoxin testingin food grade enzyme preparations derived from the three fungi, Regul Toxicol Pharmacol, 39(2), pp 0–228.
41. Berka R.M., Fowler T., Rey M.W., 1994a, Gene sequence encoding Aspergillus niger catalase-R, United States Patent 5,360,901.
42. Berka R.M., Fowler T., Rey M.W., 1994b, Production of Aspergillus niger catalase-R, United States Patent 5,360,732
43. Van Gorcom R.F.M., van Hartingsveldt W., van Paridon P.A., Veenstra A.E., Luiten R.G.M., Selten G.C.M., 1991, Cloning and expression of microbial phytase, European Patent Application 0.420.358
44. Bussink H.J.D., Kester H.C.M., Visser J., 1990, Molecular cloning, nucleotide sequence and expression of the gene encoding prepro-polygalacturonase II of
Aspergillus niger, FEBS Lett, 273, pp 127–130.
45. Selten G., 1994, The versatile Aspergillus niger, Gist, 60, pp 5–7.
46. Pariza M.W., Johnson E.A., 2001, Evaluating the safety of microbial enzyme preparations used in food processing: update for a new century, Regul Toxicol Pharmacol, 33, pp 1–14.
47. Blin K., Shaw S., Steinke K., Villebro R., Ziemert N., Lee S.Y., Medema M.H., Weber T., 2019, antiSMASH 5.0: Updates to the Secondary Metabolite Genome Mining Pipeline. Nucleic Acids Res. 47 (1), 81–87.
48. Yu R., Liu J., Wang Y., Wang H., Zhang H., 2021, Aspergillus niger as a Secondary Metabolite Factory, Front. Chem., 9, pp 701022.
49. Sakurai M., Kohno J., Yamamoto K., Okuda T., Nishio M., Kawano K., Ohnuki T., 2002, TMC-256A1 and C1, New Inhibitors of IL-4 Signal Transduction Produced by Aspergillus niger Var niger TC 1629, J. Antibiot., 55(8), pp 685– 692.
50. Leutou A.S., Yun K., Son B.W., 2016, Induced Production of 6,9-