Hình 3.36. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC (→) của hợp chất A9
Hợp chất A9 đƣợc phân lập ở dạng bột màu vàng. Các dữ kiện phổ 1H và 13C NMR của A9 cho thấy đây là một hợp chất naphthopyrone ở dạng agular. Điều này đƣợc khẳng định khi so sánh số liệu phổ của A9 với hợp chất đã biết là TMC-256C1 [49], kết hợp với phân tích phổ HSQC và HMBC (Hình 3.36). Nhƣ vậy, hợp chất A9
đƣợc xác định là TMC-256C1.
Đặc điểm hóa lý: dạng bột màu vàng. Công thức phân tử: C15H12O5. 1
H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) và 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A9 Vị trí 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 2-CH3 5-OH 10-OCH3
3.3.10. Hợp chất A10: Pyranonigrin A
Hình 3.37. Cấu trúc hóa học của hợp chất A10
Hợp chất A10 thu đƣợc ở dạng bột màu vàng. Trên phổ 1H của hợp chất xuất hiện tín hiệu của 2 proton olefin tại 6.59 (dd, 1.5, 15.5, H-1′) và 6.47 (dd, 7.0, 16.0, H-2′) cho thấy sự có mặt của một nối đôi có cấu hình trans, ngoài ra là tín hiệu của một nhóm methyl bậc 2 tại 1.94 (dd, 1.0, 6.5, H-3′) và một nhóm oxymethine tại 5.73 (br s, H-7) (Bảng 3.10). Phân tích phổ 13C NMR và HSQC ghi nhận 10 carbon, bao gồm một carbon carbonyl tại 169.0 (C-4), một nhóm amide tại 164.9 (C-5), 4 tín hiệu carbon sp2 không liên kết với proton và 2 tín hiệu carbon methine sp2, cùng với một nhóm methyl và một nhóm oxymethine. Các dữ kiện phổ 1H và 13C NMR này gợi ý hợp chất A10
thuộc nhóm γ-pyrone. Điều này đƣợc khẳng định thông qua sự tƣơng đồng hoàn toàn khi so sánh số liệu phổ NMR của A10 với một hợp chất γ-pyrone đã biết [103]. Do đó, hợp chất A10 đƣợc xác định là pyranonigrin A.
Đặc điểm hóa lý: dạng bột màu vàng. Công thức phân tử: C10H9NO5. 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) và 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A10
Vị trí δCa,b δHa,c (mult., J in Hz)
2 145.9 3 142.1 4 169.0 4a 5 6 7
1′
2′
3′
3-OH 7-OH
aĐo trong DMSO-d6, b 125 MHz, c 500 MHz
3.3.11. Hợp chất A11: Orlandin
Hình 3.38. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC (→) của hợp chất A11
Hợp chất A11 thu đƣợc ở dạng bột màu trắng. Trên phổ 1H và 13C NMR xuất hiện một cặp tín hiệu của một proton olefin tại 5.53 (s), một proton thơm singlet tại 6.67, một carbon lactone tại 161.8, và 6 carbon sp2 trong đó có 3 carbon mang oxy tại 169.7, 160.0, và 154.0 (Bảng 3.11). Các dữ kiện phổ này gợi ý hợp chất A11 có dạng cấu trúc dimer của α-benzopyrone. Điều này đƣợc khẳng định bởi sự trùng hợp hoàn toàn khi so sánh với hợp chất α-benzopyrone dimer đã công bố [104], kết hợp với các phân tích tƣơng tác phổ HSQC và HMBC (Hình 3.38). Trên cơ sở các phân tích phổ, hợp chất
A11 đƣợc xác định là orlandin.
Đặc điểm hóa lý: dạng bột màu trắng. Công thức phân tử: C22H18O8. HRESIMS: m/z
411.1073 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức phân tử C22H19O8+, 411.1074).
1
H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) và 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): trình bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A11
Vị trí 2, 2′
3, 3′ 4, 4′ 4a, 4a′ 5, 5′ 6, 6′ 7, 7′ 8, 8′ 8a, 8a′ 9, 9′ 10, 10′
aĐo trong DMSO-d6, b 125 MHz, c 500 MHz
3.3.12. Hợp chất A12: Nigerasperone C
Hình 3.39. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC (→) của hợp chất A12
Hợp chất A12 thu đƣợc ở dạng bột màu vàng. Trên phổ 1H của hợp chất xuất hiện tín hiệu singlet của 4 proton thơm, một proton olefin, 2 tín hiệu singlet của nhóm methyl, và 3 nhóm methoxy (Bảng 3.12). Phân tích phổ 13C NMR và HSQC ghi nhận 31 carbon, bao gồm 2 carbon carbonyl tại 186.2 (C-4) và 199.5 (C-4′), 22 carbon sp2 trong đó có 17 carbon không liên kết với proton và 5 carbon methine sp2, một nhóm methylene, một carbon sp3 không liên kết proton mang oxy tại 101.2 (C-2′), cùng với 2
nhóm CH3 và 2 nhóm methoxy. Các dữ kiện phổ này cho gợi ý hợp chất A12 thuộc lớp chất naphtho-γ-pyrone dimer. Điều này đƣợc khẳng định thông qua sự tƣơng đồng hoàn toàn khi so sánh số liệu phổ NMR của A12 với một hợp chất naphtho-γ-pyrone dimer đã biết [81], đồng thời đƣợc khẳng định thêm thông qua các phân tích trên phổ HSQC và HMBC (Hình 3.12). Nhƣ vậy, hợp chất A12 đƣợc xác định là nigerasperone C.
Đặc điểm hóa lý: dạng bột màu vàng. Công thức phân tử: C31H26O11. 1H NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C NMR (CD3OD, 125 MHz): trình bày ở bảng 3.12.
Bảng 3.12. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A12
Vị trí 2 3 4 4a 5 5a 6 7 8 9 9a 10 10a 2-CH3 6-OCH3 2′ 3′ 4′ 4′a
5′ 5′a 6′ 7′ 8′ 9′ 9′a 10′ 10′a 2′-CH3 6′-OCH3 8′-OCH3
aĐo trong CD3OD, b 125 MHz, c 500 MHz
3.3.13. Hợp chất A13: Asperpyrone A
Hình 3.40. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC (→) của hợp chất A13
Hợp chất A13 đƣợc phân lập ở dạng bột màu vàng. Các dữ kiện phổ 1H và 13C NMR của A13 cho thấy đây là một hợp chất naphtho-γ-pyrone dimer, với một tiểu đơn vị ở dạng agular. Điều này đƣợc khẳng định khi so sánh số liệu phổ của A13 với A12
và với hợp chất naphtho-γ-pyrone dimer đã biết [105], kết hợp với phân tích phổ HSQC và HMBC và sự xuất hiện của tín hiệu ion giả phân tử trên phổ HRESIMS (Hình 3.13). Nhƣ vậy, hợp chất A13 đƣợc xác định là asperpyrone A.
Đặc điểm hóa lý: dạng bột màu vàng. Công thức phân tử: C31H24O10. HRESIMS: m/z
557.1444 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức phân tử C31H25O10+, 557.1442).
1H NMR (Acetone-d6, 500 MHz) và 13C NMR (Acetone-d6, 125 MHz): trình bày ở
bảng 3.13.
Bảng 3.13. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A13
Vị trí 2 3 4 4a 5 5a 6 7 8 9 10 10a 10b 2-CH3 10-OCH3 2′ 3′ 4′
4′a 5′ 5′a 6′ 7′ 8′ 9′ 9′a 10′ 10′a 2′-CH3 5′-OH 6′-OCH3 8′-OCH3
aĐo trong acetone-d6, b 125 MHz, c 500 MHz
3.3.14. Hợp chất A14: 5-(Hydroxymethyl)-2-furancarboxylic acid
Hình 3.41. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HMBC (→) của hợp chất A14
Hợp chất A14 thu đƣợc ở dạng dầu không màu. Trên phổ 1H và 13C NMR xuất hiện tín hiệu của một carbon carbonyl, 2 nối đôi của một vòng furan, và một nhóm oxymethylene (Bảng 3.14). Tiến hành so sánh số liệu phổ NMR của A14 với hợp chất furan đã biết cho thấy sự trùng hợp hoàn toàn [106] và cấu trúc của A14 đƣợc khẳng định thêm với các phân tích phổ HSQC và HMBC (Hình 3.41). Nhƣ vậy, hợp chất A14
đƣợc xác định là 5-(hydroxymethyl)-2-furancarboxylic acid.
Đặc điểm hóa lý: dạng dầu không màu. Công thức phân tử: C6H6O4. 1
H NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C NMR (CD3OD, 125 MHz): trình bày ở bảng
3.14. Bảng 3.14. Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A14
1 162.0 2 145.8 3 119.9 4 110.2 5 160.6 6 57.5
aĐo trong CD3OD, b 125 MHz, c 500 MHz
3.3.15. Tổng hợp các hợp chất đã đƣợc phân lập
Bằng các phƣơng pháp phân tích phổ, cấu trúc hóa học của 14 hợp chất phân lập từ chủng nấm mốc A. niger IMBC-NMTP01 đã đƣợc xác định là: epi-aspergillusol (A1), pyrophen (A2) [69], aspernigin (A3), 2-(hydroxyimino)-3-(4- hydroxyphenyl)propanoic acid (A4) [96], aspergillusol A (A5) [95], rubrofusarin B (A6) [101], nigerasperone A (A7) [81], fonsecin (A8) [102], TMC-256C1 (A9) [49], pyranonigrin A (A10) [103], orlandin (A11) [104], nigerasperone C (A12) [81], asperpyrone A (A13) [105], and 5-(hydroxymethyl)-2-furancarboxylic acid (A14) [107] (Hình 3.42).
Hình 3.42. Cấu trúc hóa học của các hợp chất A1-A14 3.4. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất
Các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng nấm mốc A. niger IMBC-NMTP01 đƣợc đánh giá hoạt tính gây độc tế bào đối với sáu dòng tế bào ung thƣ biểu mô ở ngƣời, bao gồm: HepG2, KB, HL-60, MCF-7, SK-Mel-2 và LNCaP bằng phƣơng pháp sulforhodamine B (SRB). Kết quả là, trong số các naphtho-γ-pyrones (A6-A9), hợp chất A9 có độc tính tế bào mạnh nhất đối với tất cả các dòng tế bào, với giá trị IC50
nằm trong khoảng từ 9.1 đến 23.5 µM, trong khi hợp chất A6 (rubrofusarin B) chỉ gây độc tế bào đối với hai dòng tế bào HepG2 và MCF-7, với giá trị IC50 lần lƣợt là 77.1 và 68.3 µM (Bảng 3.15). Theo nghiên cứu của Song Y.C và cộng sự, rubrofusarin B có nguồn gốc từ chủng Aspergillus niger IFB-E003 đƣợc chứng minh là gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thƣ ruột kết SW1116 với giá trị IC50 là 4,5 µg/mL) [51].
Cả hai naphthopyrones dimeric là nigerasperone C (A12) và asperpyrone A (A13) và dẫn xuất acid furancarboxylic (A14) đều thể hiện độc tính tế bào vừa phải đối với tất cả các dòng tế bào ung thƣ biểu mô trên, với giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 47.7 đến 84.5 µM. Asperpyrone A là một hợp chất tự nhiên đƣợc phân lập từ
Aspergillus niger với các hoạt tính sinh học khác nhau là kháng u, kháng khuẩn và chống oxy hóa. Nghiên cứu của Xu K. và cộng sự 2019 đã chỉ ra rằng asperpyrone A đƣợc phân lập từ chủng Aspergillus sp. XNM-4 có độc tính tế bào mạnh trên năm dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời (PANC-1, A549, MDA-MB-231, Caco-2 và SK-OV-3) và một dòng tế bào bình thƣờng ở ngƣời (HL-7702) [108].
Bảng 3.15. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất A1-A14 Hợp chất A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7
A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 Ellipticinec
aGiá trị ± SD (n = 3); b Không có hoạt tính (> 100 µM); c Đối chứng dƣơng
Trong số hai phenethyl-α-pyrones (A1 và A2), hợp chất A1 thể hiện độc tính tế bào vừa phải đối với các dòng tế bào HepG2, KB và MCF-7, với các giá trị IC50 tƣơng ứng là 52.0, 91.2 và 65.0 µM, trong khi chất tƣơng tự (hợp chất A2), với nhóm chức acetamide ở C-6, không gây độc các dòng tế bào trên ở các nồng độ đƣợc thử nghiệm. Khả năng gây độc ở mức trung bình của ba chất chuyển hóa hydroxyimine (A3–A5) đã đƣợc quan sát thấy đối với năm dòng tế bào ung thƣ, ngoại trừ HepG2, với giá trị IC50
trong khoảng 58.7 đến 88.9 µM. Hợp chất A11 có hoạt tính yếu đối với dòng tế bào MCF-7 và SK-Mel-2, với giá trị IC50 tƣơng ứng là 91.5 và 83.8 µM.
Đáng chú ý, đây là lần đầu tiên nghiên cứu đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất A4, A5, A9, và A11, trong đó, hợp chất A9 có hoạt tính tốt, ức chế sự phát triển của 6 dòng tế bào ung thƣ nghiên cứu, điều này mở ra tiềm năng phát triển cho các nghiên cứu sâu rộng hơn đối với hợp chất này.
3.5. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế NO của các hợp chất
Khả năng ức chế NO định hƣớng kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập đƣợc đánh giá thông qua việc ức chế sản xuất quá mức NO trong các tế bào RAW264.7 đƣợc kích thích bởi LPS. Kết quả cho thấy, ngoại trừ hợp chất A2 và A13, tất cả các hợp chất đƣợc thử nghiệm đều ức chế sản sinh NO phụ thuộc vào liều lƣợng, với giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 2.1 đến 84.4 µM (bảng 3.16). Đáng chú ý, tác dụng ức chế NO của hợp chất A9 (TMC-256C1) với giá trị IC50 = 2.1 µM mạnh hơn so với đối chứng dƣơng, L-NMMA (IC50 = 7.6 µM). Trƣớc đó, hợp chất TMC-256C1 phân lập từ chủng
Aspergillus niger var niger TC 1629 đƣợc xác định là chất ức chế dẫn truyền tín hiệu IL-4 [49]. Nghiên cứu của Kim và cộng sự năm 2016 đã chỉ ra rằng
TMC-256C1 từ chủng Aspergillus sp. SF-6354 có hoạt tính bảo vệ chống lại độc tính tế bào do glutamate gây ra trong tế bào HT22. TMC-256C1 còn thể hiện tác dụng chống viêm thần kinh trong các tế bào vi mô BV2 đƣợc tạo ra bởi lipopolysaccharides (LPS). TMC-256C1 còn ngăn chặn sự sản xuất các chất trung gian gây viêm là NO và PGE2 do LPS gây ra thông qua việc ức chế biểu hiện protein iNOS và COX-2 [109].
Nigerasperone A (hợp chất A7) cho thấy tác dụng ức chế NO đáng kể (IC50 = 7.4 M) tƣơng đƣơng với tác dụng của L-NMMA. Điều thú vị là tác dụng ức chế NO của rubrofusarin B (hợp chất A6) (IC50 = 84.4 µM) có nhóm metyl ở C-3 thấp hơn đáng kể so với tác dụng của chất tƣơng tự hydroxyl hóa của nó (hợp chất A7). Các hợp chất A1, A4, A10, A12 và A14 ức chế đáng kể sự sản sinh NO, với giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 14.5 đến 24.0 µM, trong khi các hợp chất A3, A5 và A11 thể hiện tác dụng ức chế trung bình, với giá trị IC50 trong khoảng 41.3 đến 56.0 µM.
Đây là lần đầu tiên nghiên cứu hoạt tính ức chế NO của các hợp chất A2, A4- A8, và A10-A12, trong đó hợp chất A7 (nigerasperone A) có hoạt tính ức chế NO định hƣớng kháng viêm rất tốt.
Bảng 3.16. Hoạt tính ức chế NO của các hợp chất A1-A14 Hợp chất
3.6. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các hợp chất
Các hợp chất A1–A14 phân lập từ chủng nấm mốc A. niger IMBC-NMTP01 đƣợc thử nghiệm hoạt tính kháng sinh đối với các vi sinh vật kiểm định, bao gồm vi khuẩn Gram dƣơng (Enterococcus faecalis ATCC299212, Staphylococcus aureus ATCC25923 và
Bacillus cereus ATCC13245), ba chủng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC25922,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, và Salmonella enterica ATCC13076), và một chủng nấm men Candida albicans ATCC 24433. Kết quả cho thấy tất cả các hợp chất ức chế đáng kể sự phát triển của vi khuẩn Gram dƣơng
E. faecalis, với giá trị MIC là 32 hoặc 64 µM, tuy nhiên không có sự ức chế nào đƣợc ghi nhận đối với năm chủng vi khuẩn còn lại (Bảng 2.2.1). Ngoài ra, tất cả các hợp chất, ngoại trừ hợp chất A10, thể hiện hoạt tính ức chế sự sinh trƣởng của nấm men
Candida albicans, với giá trị MIC từ 64-128 µM.
Trong nghiên cứu này, hợp chất A6 (rubrofusarin B) ức chế sự phát triển của vi khuẩn E.faecalis và chủng nấm men C.albican. Trƣớc đó, nghiên cứu của Song Y.C và cộng sự đã chỉ ra rằng rubrofusarin B có nguồn gốc từ chủng Aspergillus niger IFB- E003 thể hiện sự ức chế tăng trƣởng so với năm dòng vi sinh vật bao gồm 3 chủng vi khuẩn (B. subtilis, E. coli, P. fluorescence) và 2 chủng nấm 1 (T. rubrum và C. albicans) với giá trị MIC trong khoảng từ 1,9 đến 31,2 µg/mL [51].
Đáng chú ý, đây là lần đầu tiên hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất A4, A5,
A7, A9, A11 và A12 đƣợc nghiên cứu.
Bảng 2.2.1. Tác dụng kháng sinh của các hợp chất A1-A14
Hợp chất
A1 A2 A3
A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 Streptomycin* Nystatin*
EF: E. faecalis ATCC299212; SA: S. aureus ATCC25923; BC: B. cereus
ATCC13245; EC: E. coli ATCC25922; PA: P. aeruginosa ATCC 9027; SE: S. enterica ATCC13076; CA: C. albicans ATCC 24433;* Đối chứng dƣơng; (-): không có hoạt tính.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
- Đã tạo đƣợc 5.2 g cao chiết tổng từ sinh khối lên men của chủng nấm mốc
Aspergillus niger IMBC-NMTP01 phân lập từ hạt lạc.
- Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 14 hợp chất bao gồm 2 hợp chất mới epi-aspergillusol (A1) và aspernigin (A3), và 12 hợp chất đã biết: pyrophen (A2), 2-(hydroxyimino)-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid (A4), aspergillusol A (A5), rubrofusarin B (A6), nigerasperone A (A7), fonsecin (A8), TMC-256C1 (A9), pyranonigrin A (A10), orlandin (A11), nigerasperone C (A12), asperpyrone A (A13), và 5-(hydroxymethyl)-2-furancarboxylic acid (A14) từ cao chiết tổng của chủng nấm mốc Aspergillus niger IMBC-NMTP01.
- Các hợp chất A9, A12–A14 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với tất cả các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm HepG2, KB, HL-60, 7MCF-7, SK-Mel2 và LNCaP (IC50 = 9.1–83.4 µM). Các hợp chất A3-A5 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với năm dòng tế bào KB, HL-60, MCF-7, SK-Mel2 và LNCaP (IC50 = 58.7–89.2 µM). Hợp chất A1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào HepG2, KB và MCF-7 (IC50 = 52.0–91.2 µM).
- Các hợp chất A1, A3–A12 thể hiện hoạt tính ức chế sản sinh quá mức NO ở tế bào RAW264.7 kích thích bởi LPS (IC50 = 2.1–84.4 µM).
- Tất cả các hợp chất A1–A14 đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với E. faecalis (MIC = 32–64 µM). Các hợp chất A1–A9, A10–A14 thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của nấm men C. albicans (MIC = 64–128 µM).
Kiến nghị
Cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động ở cấp độ phân tử của các hợp chất có hoạt tính sinh học phát hiện từ chủng Aspergillus niger IMBC-NMTP01.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
Tran Hong Quang, Nguyen Viet Phong, Le Ngoc Anh, Tran Thi Hong Hanh, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Thi Thanh Ngan, Nguyen Quang Trung, Nguyen Hoai Nam &