Hình 2.1 VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 đƣợc sản xuất ti IVAC
2 3 Phƣơng pháp xác định các đặc tính ỹ thuật
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm
Hình 2.2. Sơ đồ tổng quát của nghiên cứu
Sả n phẩ m ng hi ên cứu Lô R aP 01 Xác định đặc tính kỹ thuật của lô RaP01
Vô trùng, an toàn, nhận dạng Đặc tính cảm quan, vật lý Hóa học Đặc tính kháng nguyên Xác định ĐVMD Thực hiện 6 lần với MCQT Nghiên cứu tính ổn định
Nhiệt độ bảo quản (-40oC± 2oC) Nhiệt độ 5oC ± 3 oC Thúc đẩy nhanh 25 oC± 2 oC 37oC ± 2 oC 45 oC ± 2 oC
2.3.2. Phƣơng pháp xác định các đặc tính kỹ thuật
2.3.2.1. Phương pháp kiểm tra vô trùng
Môi trƣờng dùng cho thử nghiệm:
- Môi trƣờng Thioglycolate: Dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu hí và nấm. - Môi trƣờng TSB (Tryptone Soya Broth): Dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu hí và ị hí
Mỗi lo t môi trƣờng phải kiểm tra chất lƣợng về tính vô trùng tính t ng sinh trƣớc khi sử dụng.
Cách tiến hành:
- Hoàn nguyên 10 ống mẫu chuẩn ho gà đông hô trong nƣớc cất pha tiêm vô huẩn.
- Cấy hỗn dịch mẫu thử đã hoàn nguyên ho gà của mỗi ống vào 1 ống môi trƣờng Thioglycolate và 1 ống môi trƣờng TSB Lƣợng mẫu cấy vào môi trƣờng là 0 5%
- Sau khi cấy mẫu thử xong ủ các ống môi trƣờng Thioglycolate ở nhiệt độ 30°C – 35°C và các ống môi trƣờng TSB ở nhiệt độ 20°C – 25°C trong 14 ngày
Đọc kết quả:
- Hàng ngày theo dõi và ghi chép Đọc kết quả cuối cùng vào ngày thứ 14. - Mẫu chuẩn đƣợc coi là vô trùng hi hông c ống môi trƣờng nào bị nhiễm (c vi sinh vật phát triển).
2.3.2.2. Phương pháp kiểm tra nhận dạng kháng nguyên PT, FHA
VXMC ho gà vô bào đông hô đƣợc hồi chỉnh với nƣớc cất sau đ giải hấp phụ Al(OH)3 bằng Natri Citrate. Nhận d ng háng nguyên PT FH dựa trên sự kết hợp đặc hiệu với háng thể tƣơng ứng trong gel th ch theo nguyên lý của phản ứng miễn dịch khuếch tán vòng ép (Ouchterlony) Kháng nguyên PT FH từ các giếng đƣợc khuếch tán ra xung quanh sẽ phản ứng với háng thể đặc hiệu t o thành đƣờng kết tủa trên gel th ch:
- T i chứng dƣơng: Xuất hiện đƣờng tủa của háng thể PT, FHA với háng nguyên PT FH chuẩn.
- T i chứng m (PBS): Không xuất hiện đƣờng tủa.
Vắc xin đƣợc coi là đ t tiêu chuẩn khi t i vị trí iểm tra dung dịch xuất hiện đƣờng tủa màu xanh của háng thể PT, FHA với háng nguyên PT FH c trong vắc xin.
2.3.2.3. Phương pháp kiểm tra an toàn chung
Phƣơng pháp: Thử nghiệm đƣợc tiến hành trên chuột nhắt và chuột lang. Mỗi chuột nhắt đƣợc tiêm ổ bụng với liều tiêm hông quá 1 liều đơn cho ngƣời và mỗi chuột lang đƣợc tiêm ổ bụng với liều tiêm hông quá 5 liều đơn cho ngƣời. Thể tích tiêm hông quá 1 ml cho một chuột nhắt và hông quá 5 ml cho một chuột lang. Chuột phải đƣợc quan sát ỹ 2 giờ đầu sau hi tiêm và trong thời gian ít nhất 7 ngày thử nghiệm C n trọng lƣợng chuột vào ngày thứ 3 và thứ 7 sau hi tiêm
Tiêu chuẩn: Toàn bộ chuột thí nghiệm sống s t hỏe m nh lên c n trong suốt thời gian thí nghiệm.
2.3.2.4. Phương pháp kiểm tra cảm quan và tính chất vật lý
Ở d ng đông hô:
+ Tiêu chí đánh giá: Quan sát bằng mắt thƣờng hình d ng màu sắc và độ đồng d ng của sản phẩm.
+ Tiêu chuẩn chấp nhận: D ng bánh hông bong teo sau hoàn nguyên t o hỗn dịch đồng nhất màu trắng đục.
- Kiểm tra chân không: phát ánh sáng xanh hi iểm tra trên máy Tesla Coil (Nhật). Yêu cầu: ống vắc xin ho gà vô bào đông hô phải đ t đƣợc độ ín
- Kiểm tra độ ẩm tồn dư:
Số lƣợng mẫu: 6 ống.
Nguyên tắc: Xác định lƣợng nƣớc c trong sản phẩm bằng cách làm bay hơi nƣớc ở nhiệt độ nhất định C n sản phẩm trƣớc và sau hi sấy, từ đ tính ra phần tr m nƣớc c trong sản phẩm.
Tiến hành:
- Bật máy hút ẩm trƣớc khi tiến hành 1 giờ.
- Sấy cốc thủy tinh ở 105°C đến trọng lƣợng hông đổi. - Lấy cốc cho vào bình hút ẩm để nguội đến nhiệt độ thƣờng. - Sau đ tiến hành c n cốc: m1.
- C n cốc chứa mẫu: m2.
- Sấy cốc mẫu ở nhiệt độ 105°C đến trọng lƣợng hô hông đổi (khoảng 4 giờ).
- Lấy cốc đặt nhanh vào bình hút ẩm Để nguội đến nhiệt độ phòng - C n cốc mẫu sau khi sấy: m3.
- Tính toán:
Độ ẩm (%)
x 100
Trong đ : m1: Trọng lƣợng cốc
m2: Trọng lƣợng cốc và mẫu trƣớc khi sấy m3: Trọng lƣợng cốc và mẫu sau khi sấy Yêu cầu: ≤ 3%.
- Kiểm tra độ đồng đều khối lượng:
Số lƣợng mẫu: 20 ống.
Phƣơng pháp: C n xác định trọng lƣợng hô của sản phẩm trong mỗi ống. Mỗi sản phẩm c n ít nhất 20 ống Xác định SD và CV%.
Yêu cầu: CV ≤ 7 5%.
Ở d ng sau hoàn nguyên:
- Kiểm tra tốc độ tạo hỗn dịch đồng nhất sau hoàn nguyên:
Phƣơng pháp kiểm tra: Hoàn nguyên mẫu chuẩn đông hô trong nƣớc cất pha tiêm quan sát và ghi nhận thời gian mẫu thử đông hô t o thành hỗn dịch đồng nhất sau hoàn nguyên
Yêu cầu: Thời gian t o hỗn dịch đồng nhất ≤ 60 gi y
- Kiểm tra pH:
Số lƣợng mẫu: 10 - 20 ml.
Phƣơng pháp kiểm tra: Phƣơng pháp đo điện thế - điện cực bằng máy đo pH.
pH là một số biểu thị quy ƣớc nồng độ ion hydrogen của dung dịch nƣớc là logarit của nghịch đảo ho t độ ion hydro tính bằng ion gam/lit Đối với dung dịch loãng ho t độ xấp xỉ bằng nồng độ ta c :
pH = _ lg CH+
Trị số pH cho ta biết tính chất axit hay iềm của một dung dịch pH = 7 biểu thị môi trƣờng trung tính pH> 7 biểu thị môi trƣờng iềm pH< 7 biểu thị môi trƣờng axit
pH của một dung dịch đƣợc xác định bằng cách đo thế hiệu giữa điện cực chỉ thị nh y cảm với ion hydrogen (điện cực thủy tinh) và một điện cực so sánh (điện cực calomen bão hòa)
Yêu cầu: pH = 6 - 7.
2.3.2.5. Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu hóa học - Kiểm tra hàm lượng tá chất Al(OH)3:
Phƣơng pháp: Chuẩn độ Complexon.
Nguyên tắc: Gel nhôm trong mẫu vắc xin hấp phụ đƣợc hòa tan bằng cách đun n ng với axit đậm đặc. Ion Al3+
sẽ t o phức với muối Natri Ethylendiamintetraacetate (Na2-EDT ) dƣ sau đ lƣợng EDT còn l i đƣợc chuẩn độ ngƣợc với dung dịch sunfat đồng CuSO4. Khoảng tuyến tính 0 4 – 11 mg Al.
Cách tiến hành: Hoàn nguyên mẫu chuẩn đông hô, sau đ lấy 3 ml mẫu thử + 8 giọt HNO3 đậm đặc + 1 ml H2SO4 đậm đặc Đun ống nghiệm trên bếp điện cách cát trong tủ hút hí độc, thấy h i trắng dày đặc thoát ra Tiếp tục đun n ng (c thể cho thêm vài giọt HNO3) cho đến khi dung dịch trong ống nghiệm trong suốt hông màu Để nguội và thêm 10 ml nƣớc cất. Dùng chỉ thị màu methyl da cam để thêm NaOH 50% vào mỗi ống nghiệm cho đến hi c màu đỏ cam. Nếu dung dịch đục thì thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Chuyển dung dịch trong ống nghiệm sang bình tam giác tráng s ch ống nghiệm 3 lần bằng 25 ml nƣớc cất Thêm vào mỗi bình 25 ml dung dịch EDTA 0,01 M, 10 ml dung dịch đệm acetat pH 4 4; đun sôi nhẹ trong 3 phút và thêm 1 ml chỉ thị màu pyridinazonaphtol Chuẩn độ n ng bằng dung dịch CuSO4 0 01 M cho đến khi dung dịch chuyển từ màu vàng hồng sang n u tía Bắt đầu với mẫu trắng các mẫu còn l i đƣợc chuẩn độ tới điểm cuối cùng màu với mẫu trắng.
Tính ết quả:
Al3+ (mg/ml) ( )
Al(OH)3 (mg/ml) = Al3+(mg/ml) x 2,89 Trong đ :
N: Lƣợng dung dịch CuSO4 0 01 M dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml) n: Lƣợng dung dịch CuSO4 0 01 M dùng để chuẩn độ mẫu thử (ml) 0 2698: Lƣợng Al3+
tƣơng đƣơng với 1 ml CuSO4 0,01 M (mg) 2 89: Lƣợng Al(OH)3 tƣơng đƣơng với 1 mg Al3+ (mg)
Tiêu chuẩn chấp nhận: Hàm lƣợng tá chất nhôm trong hoảng ≤ 2.5 mg/ml.
- Hàm lượng Merthiolate:
Hàm lƣợng chất bảo quản Merthiolate đƣợc xác định bằng cách đo quang ở bƣớc s ng 470 nm với sự tham gia của Diphenilthiocacbazon (dithizon) và chiết trong Chloroform. Cách tiến hành nhƣ sau:
+ Rửa các phễu chiết và bình tam giác nút mài bằng axit nitric đậm đặc, tráng rửa s ch bằng nƣớc cất.
+ Đƣờng chuẩn: Cho vào mỗi bình theo thứ tự: 0; 0,4; 0,8; 1 2 và 1 6 ml dung dịch chuẩn Merthiolate 0,01%.
+ Cho dung dịch mẫu thử vào hai bình hác mỗi bình 1 ml.
+ Thêm vào mỗi bình theo thứ tự 10 ml dung dịch amonium acetate 1% pH = 6, 10 ml dung dịch dithizone 0,01% mới pha trong Chloroform. Lắc trong 45 gi y
+ Tách cẩn thận lớp Chloroform qua phễu chiết và cho vào cống đo + Đo quang ở bƣớc s ng = 470 nm.
+ Hàm lƣợng Merthiolate trong mẫu tính bằng % theo công thức:
10 1000 1 100 (%) a x ax X Trong đ :
a: số mg Merthiolate của mẫu thử tính theo đƣờng chuẩn 100: Tính ra %
1000: đổi mg ra g
1: Lƣợng mẫu đem ph n tích Tiêu chuẩn: ≤ 0,02%.
- Hàm lượng muối Natri clorid:
Hàm lƣợng muối Natri clorid đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Mohr: Dựa trên phản ứng xác định ion Cl- bằng dung dịch b c nitrat (AgNO3) 0,1 N với chỉ thị màu Kali cromat K2CrO4 10%. Từ lƣợng AgNO3 tiêu thụ suy ra hàm lƣợng NaCl.
Ag+ + Cl- AgCl (trắng) 2Ag+ + CrO42- Ag2CrO4 (đỏ g ch) + Lắc đều mẫu thử.
+ Hút chính xác 1 ml mẫu vào bình tam giác dung tích 100 ml + Thêm 3 ml nƣớc cất và 3 giọt K2CrO4 10%, lắc đều.
+ Chuẩn độ bằng dung dịch AgNO3 0 1 N cho đến khi xuất hiện kết tủa màu đỏ g ch. Ghi số N ml AgNO3 đã dùng
+ Tính toán theo công thức:
1000 * 1 100 * 85 , 5 * /l N mgNaCl (%) Trong đ :
1 ml dung dịch AgNO3 0 1 N tƣơng ứng với 5,85 mg NaCl N: số ml AgNO3 0 1 N dùng để chuẩn độ mẫu thử
100: tính theo % 1000: đổi mg ra g
Tiêu chuẩn: 0 7 – 1,0%.
- Hàm lượng Formaldehyde:
Định lƣợng Formaldehyde bằng cách đo cƣờng độ màu của 3,5- diacetyl-1,4-dihydrolutidin ở bƣớc s ng 412 nm Phức hợp này c màu vàng chanh đƣợc t o thành do phản ứng của Formaldehyde tự do trong mẫu kiểm tra với Acetylaceton và amoni trong môi trƣờng acid yếu ở nhiệt độ cao để t ng tốc độ phản ứng. Cách tiến hành nhƣ sau:
+ Hút chính xác 1 ml dung dịch mẫu thử cho vào ống nghiệm.
+ X y dựng đƣờng chuẩn: Cho lần lƣợt vào các ống nghiệm chính xác 0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 ml dung dịch chuẩn Formaldehyde 2 g/ml Hàm lƣợng Formaldehyde tƣơng ứng trong mỗi ống nghiệm là 0; 0 8; 1 6; 2 4; 3 2; 4,0 g.
+ Thêm nƣớc cất vào mỗi ống nghiệm vừa đủ 2 ml.
+ Thêm vào mỗi ống nghiệm 2 ml dung dịch đệm acetate (pH= 6).
+ Đặt mẫu và chuẩn vào bếp cách thủy ở 60oC trong 10 phút Dung dịch c màu vàng chanh
+ Lấy ra làm nguội với nƣớc l nh từ 2 – 3 phút Đo quang ở bƣớc s ng 412 nm trong vòng 30 phút
Tiêu chuẩn: Hàm lƣợng Formaldehyde ≤ 0,01%.
2.3.2.6. Kiểm tra các đặc tính kháng nguyên - Xác định hàm lượng protein toàn phần:
Hàm lƣợng protein đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Lowry. Dung dịch chuẩn đƣợc sử dụng là Albumin huyết thanh bò (BS – Bovine serum albumin).
Tiến hành: 5 mg mẫu hòa tan với 1 ml nƣớc cất. Lấy 100 µl dung dịch mẫu hòa với 2,9 ml nƣớc cất trong ống nghiệm pyrex. Thêm 1 0 ml dung dịch A (Lowry reagent – code: L3540 – Sigma) vào ống nghiệm lắc đều để yên trong 20 phút Sau đ thêm 0 5 ml thuốc thử Folin 0,4 N, lắc đều và để yên trong 30 phút Sau 30 phút tiến hành đo mật độ quang ở bƣớc s ng 𝜆 = 750 nm. Thực hiện thí nghiệm với mẫu lặp và lấy giá trị trung bình Sử dụng chất chuẩn BSA (0,5 mg/ml) để tiến hành x y dựng đƣờng chuẩn.
- Xác định độ hấp phụ của kháng nguyên PT và FHA trong tá chất nhôm:
Chuẩn bị mẫu:
+ Hoàn nguyên 10 ống vắc xin đông hô trong 10 ml nƣớc cất vô trùng Ly t m lấy nƣớc nổi (phần mẫu để xác định lƣợng háng nguyên hông hấp phụ).
+ Hoàn nguyên 10 ống vắc xin đông hô hác trong 10 ml dung dịch Natri Citrate để đ t nồng độ Natri Citrate cuối cùng 0 5% Ủ 48 giờ/37oC để giải hấp phụ háng nguyên ra hỏi gel Al(OH)3 (phần mẫu để xác định háng nguyên toàn phần).
Xác định hàm lƣợng háng nguyên: Thực hiện phản ứng ELISA để xác định hàm lƣợng háng nguyên PT hoặc FHA trong mẫu thử đã chuẩn bị ở trên
Tính độ hấp phụ: Độ hấp phụ là tỷ lệ giữa lƣợng háng nguyên đã hấp phụ trên l(OH)3 so với lƣợng háng nguyên tổng số c trong vắc xin ban đầu theo công thức:
Độ hấp phụ
- Thử nghiệm xác định công hiệu ho gà:
Chuẩn bị chuột:
+ Chuột nhắt trắng 3-4 tuần tuổi, sau khi chọn lựa chuột đƣợc ph n vào các lồng chia riêng chuột đực cái vào các lồng hác nhau
+ Chuột đƣợc ph n ngẫu nhiên vào các lồng. Mỗi lồng 12-13 con cùng giới, mỗi độ pha gồm 2 lồng (đối với nh m chuột tiêm miễn dịch). Chuột đƣợc đánh dấu nhằm ph n biệt giữa các độ pha và giữa các lô thử nghiệm.
Pha loãng VXMC, VXMT: - Pha vắc xin chuẩn:
+ Sát trùng ống VXMC bằng bông cồn 70°
+ Dùng cƣa sắt nhỏ cƣa quanh cổ và 1/3 trên của đầu ống rồi bẻ ống theo 2 thì (1/3 trên đến cổ ống).
+ Hoàn nguyên vắc xin mẫu chuẩn bằng nƣớc muối sinh lý vô trùng theo tỷ lệ thích hợp với từng lo i vắc xin để đƣợc dung dịch gốc (độ pha A). Tiếp tục pha loãng bậc 5 thành các độ pha sao cho sau khi thử thách ED50 nằm giữa 3 độ pha loãng
- Pha vắc xin thử:
+ Sát trùng ống VXMT bằng bông cồn 70°
+ Dùng cƣa sắt nhỏ cƣa quanh cổ và 1/3 trên của đầu ống rồi bẻ ống theo 2 thì (1/3 trên đến cổ ống).
+ Hoàn nguyên VXMT bằng nƣớc muối sinh lý + Pha loãng bậc 5 thành các độ pha.
Tiêm miễn dịch cho chuột:
- Tiến hành tiêm trên các nh m chuột sau hi chúng đã đƣợc n uống đầy đủ 1 giờ.
- Tiêm miễn dịch cho chuột theo thứ tự từ loãng đến đặc (từ độ pha C đến A) cho cả lô VXMT và mẫu chuẩn.
- Liều/đƣờng tiêm: 0 5 ml/con/ổ bụng.
Ch m s c chuột thí nghiệm: Chuột đƣợc n uống đầy đủ và vệ sinh lồng chuồng trong 21 ngày sau hi tiêm miễn dịch. Trong thời gian miễn dịch (21 ngày) chuột phải khoẻ và t ng trọng bình thƣờng.
Pha tiêm thử thách:
- Liều LD50 đƣợc dò trƣớc hi tiêm thử thách
- Sau hi tiêm miễn dịch 21 ngày chuột đƣợc tiêm thử thách với chủng ho gà 18323
- Pha chủng thử thách: Chủng ho gà 18323 chứa 10.109/ml (A0) đƣợc pha loãng nhƣ sau:
A1 = 10.109/2 ml = 1 ml A0 + 1 ml đệm Casein 1% A2 = 109/2 ml = 1 ml A1 + 9 ml đệm Casein 1% A3 = 106/0,02 ml = 1 ml A2 + 9 ml đệm Casein 1% A4 = 105/0,02 ml = 1 ml A3 + 9 ml đệm Casein 1% A5 = 50000/0,02 ml = 6 ml A4 + 6 ml đệm Casein 1% A6 = 5000/0,02 ml = 1 ml A5 + 9 ml đệm Casein 1% A7 = 500/0,02 ml = 1 ml A6 + 9 ml đệm Casein 1% A8 = 100/0,02 ml = 1 ml A7 + 4 ml đệm Casein 1% A9 = 20/0,02 ml = 1 ml A8 + 4 ml đệm Casein 1%
Tiêm thử thách:
- Tiêm não 10 chuột (nh m chứng m) mỗi con 0,02 ml dung dịch Casein 1% để c những thông tin về sự phá huỷ não hông đặc hiệu: Dùng bơm im tiêm Hamitol tiêm vào não chuột ở 3 nh m chứng, mỗi nh m 10 con (đƣợc nuôi song song cùng với chuột đã tiêm miễn dịch), mỗi con tiêm 0,02 ml các độ pha theo thứ tự: A9 - A8 - 7 để kiểm tra độc lực của chủng thử thách
- Dung dịch A5 chứa 50.000 vi khuẩn/0,02 ml/chuột dùng để tiêm thử