Hình 2.1 VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 đƣợc sản xuất ti IVAC
2 36 Phƣơng pháp xử lý số liệu
3.1.1. Kết quả kiểm tra vô trùng
Thử nghiệm vô trùng nhằm phát hiện tác nh n ngo i lai là các vi sinh vật sống (vi khuẩn, nấm) nhiễm vào sản phẩm. Mẫu chuẩn dự tuyển ho gà vô bào RaP01 đƣợc kiểm tra vô trùng ở 2 giai đo n: Vắc xin bán thành phẩm (d ng nƣớc) và vắc xin thành phẩm (d ng đông hô) Sau thời gian theo dõi 14 ngày tất cả các mẫu kiểm tra đều hông phát hiện c sự hiện diện của vi khuẩn và nấm trên các môi trƣờng đặc hiệu Thioglycolate (TGF) và Tryptone Soya Broth (TSB).
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra vô trùng mẫu RaP01
Kết quả hình 3 1 cho thấy lô vắc xin ho gà vô bào dự tuyển MCQG đ t yêu cầu về vô trùng theo tiêu chuẩn của WHO và DĐVN V 2018.
3.1.2. Kết quả kiểm tra nhận dạng kháng nguyên aP
Kháng nguyên aP của vắc xin RaP01 đƣợc nhận d ng thông qua phản ứng khuếch tán miễn dịch ép (Ouchterlony) của 2 háng nguyên thành phần là PT và FH Sự di chuyển của háng thể đặc hiệu (ở giếng giữa) và háng nguyên (ở các giếng xung quanh) trong bản gel agarose 1% khi gặp nhau sẽ t o đƣờng kết tủa màu xanh của thuốc nhuộm Coomassie. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3 2 và bảng 3.1.
Hình 3.2. Kết quả sau nhuộm của thí nghiệm nhận d ng háng nguyên PT và FHA trong mẫu vắc xin RaP01
Bảng 3.1. Kết quả nhận d ng háng nguyên FH và PT trong mẫu vắc xin RaP01 Giếng Mẫu Giếng 1 Kháng FHA chuẩn (NIBSC 97/564) Kháng độc tố PT chuẩn (NIBSC 97/572) 2, 3 Kháng nguyên FHA chuẩn Xuất hiện đƣờng kết tủa - Kháng nguyên
PT chuẩn - Xuất hiện đƣờng kết tủa
4, 5 Mẫu vắc xin RaP01
Xuất hiện đƣờng
kết tủa Xuất hiện đƣờng kết tủa
6, 7 PBS Không xuất hiện
đƣờng kết tủa
Không xuất hiện đƣờng kết tủa
Kết quả cho thấy đã nhận diện các háng nguyên PT và FH hiện diện trong vắc xin RaP01.
3.1.3. Kết quả kiểm tra an toàn chung
Tiêu chuẩn về an toàn chung của VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 đƣợc thử trên hai lo i động vật thí nghiệm là chuột nhắt và chuột lang. Kết quả cho thấy tất cả chuột thử nghiệm đều sống, khỏe m nh và lên c n Sau 7 ngày theo dõi trọng lƣợng t ng trung bình của mỗi chuột nhắt là 8 38 g Đối với thử nghiệm an toàn chung trên chuột lang t ng trọng trung bình là 45 g. Biểu đồ t ng trƣởng của chuột lang và chuột nhắt trong thử nghiệm an toàn chung của vắc xin dự tuyển mẫu chuẩn ho gà vô bào đƣợc trình bày ở hình 3 3 và 3.4.
Hình 3.3. T ng trọng trung bình của chuột nhắt trong thử nghiệm an toàn chung VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01
Hình 3.4. T ng trọng trung bình của chuột lang trong thử nghiệm an toàn chung VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01
Các ết quả thử an toàn chung cho thấy mẫu chuẩn ho gà vô bào đáp ứng tiêu chuẩn về an toàn chung của vắc xin ho gà vô bào theo tiêu chuẩn DĐVN V, 2018.
3.1.4. Kết quả kiểm tra cảm quan và tính chất vật lý
Vắc xin RaP01 sau đông hô đƣợc kiểm tra tính chất vật lý ở 2 tr ng thái: đông hô và sau hoàn nguyên
Ở tr ng thái đông hô sản phẩm đƣợc đánh giá các chỉ tiêu: cảm quan (hình d ng màu sắc) độ ch n hông (độ ín) hối lƣợng hô và độ ẩm tồn dƣ
Ở tr ng thái sau hoàn nguyên sản phẩm đƣợc đánh giá các chỉ tiêu: tốc độ t o huyền dịch sau hoàn nguyên thời gian lắng cặn và độ pH của vắc xin.
Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra cảm quan và tính chất vật lý của vắc xin RaP01 (ở tr ng thái đông hô)
STT Chỉ tiêu
đánh giá Tiêu chuẩn
Số lƣợng
mẫu Kết quả
1 Hình d ng
Bánh đông hô màu trắng bong hông teo Toàn bộ Phù hợp 2 Màu sắc Trắng đục Toàn bộ Phù hợp 3 Độ ch n hông 100% Toàn bộ 100% 4 Độ ẩm tồn dƣ ≤ 3% 6 ống 2 18 ± 0 08 5 Khối lƣợng hô (mg) Ghi nhận 10 ống 11,90 ± 0 161 6 Độ lệch khối lƣợng ≤ 7 5% 10 ống 1,35
Dextran đƣợc bổ sung vào trong vắc xin trƣớc hi đông hô với vai trò nhƣ là một lo i tá dƣợc vừa c tác dụng bảo vệ háng nguyên trong quá trình đông hô vừa giúp định hình d ng của sản phẩm sau đông hô Thông thƣờng các sản phẩm đông hô sử dụng Dextran làm tá dƣợc sẽ t o thành hình bánh theo huôn của vật liệu chứa n Vì vậy vắc xin RaP01 đông hô sẽ c d ng
hình bánh màu trắng đục (màu của Hydroxyt nhôm) Khi lắc hay gõ nhẹ vào thành ống, bánh sẽ tách hỏi huôn đáy của ống và bong ra giữ nguyên hình dáng với cấu trúc hô mịn và xốp. Kiểm tra 100% các ống cho thấy đều đ t yêu cầu về cảm quan nhƣ đã mô tả trong tiêu chuẩn cơ sở (hình 3 5).
Hình 3.5. VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 đông hô
Vắc xin sau đông hô đƣợc hàn ín dƣới điều kiện ch n hông Ho t chất trong vắc xin là háng nguyên ho gà aP c bản chất là protein sẽ giữ đƣợc ổn định l u dài hơn trong môi trƣờng ch n hông Kết quả kiểm tra ch n hông cho thấy 100% các ống đều đ t yêu cầu (phát ánh sáng xanh hi iểm tra trên máy Tesla Coil - Nhật). Kết quả này cũng cho thấy sản phẩm đ t yêu cầu về độ ín
Độ ẩm tồn dƣ của sản phẩm vắc xin đông hô n i chung là chỉ số quan trọng và ảnh hƣởng trực tiếp tới chất lƣợng và độ ổn định của vắc xin đặc biệt là các VXMC cần thời gian sử dụng và lƣu trữ thời gian dài trên 10 n m theo quy định của WHO Độ ẩm tồn dƣ thực chất là xác định lƣợng nƣớc còn l i trong sản phẩm đông hô lƣợng nƣớc này cao sẽ khiến phản ứng giáng h a protein háng nguyên ho gà tiếp tục diễn ra ảnh hƣởng đến hàm lƣợng kháng nguyên ho gà trong ống mẫu vắc xin. Do vậy độ ẩm tồn dƣ thấp thì độ ổn định sẽ cao và ngƣợc l i Ngoài ra độ ẩm tồn dƣ cũng giúp đánh giá quá trình đông hô cũng nhƣ ỹ thuật hàn ống ch n hông trên các thiết bị sản xuất vắc xin thƣơng m i c đáp ứng đƣợc yêu cầu của một mẫu chuẩn đông
hô hay hông Kết quả cho thấy độ ẩm tồn dƣ của lô vắc xin ho gà vô bào RaP01 là 2 18% đ t yêu cầu chất lƣợng theo tiêu chuẩn dự kiến của VXMC ho gà vô bào đông hô và tiêu chuẩn của WHO (TRS No. 979 phần 4, 2013).
Hình 3.6. Độ ẩm tồn dƣ của các ống vắc xin RaP01 đông hô
Khối lƣợng hô của các ống vắc xin RaP01 dao động từ 11,63 mg/ống đến 12,18 mg/ống trung bình 11 90 ± 0 161 mg/ống (bảng 3.2 và hình 3 6).
Hình 3.7. Khối lƣợng hô của các ống vắc xin RaP01 đông hô
Độ lệch về khối lƣợng giữa các ống đƣợc tính bằng hệ số ph n tán (CV%). Hệ số CV càng thấp, chứng tỏ sự đồng đều về liều lƣợng giữa các ống
càng cao Tiêu chuẩn độ đồng đều về khối lƣợng đối với VXMC ho gà vô bào đông hô là một trong những tiêu chuẩn đặc biệt quan trọng vì mỗi một ống vắc xin sẽ trở thành thƣớc đo giá trị công hiệu của vắc xin ho gà mẫu thử cho mỗi lần thử nghiệm công hiệu. Kết quả xác định độ đồng đều khối lƣợng giữa các ống vắc xin RaP01 thể hiện qua hệ số CV là 1 35% đáp ứng tiêu chuẩn cơ sở cho VXMC ho gà vô bào Đ y là một hệ số rất thấp, thậm chí giá trị này c thể còn nằm trong giới h n của độ đảm bảo đo (sai số giữa các lần đo)
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra tính chất vật lý vắc xin ho gà vô bào RaP01 (ở tr ng thái sau hoàn nguyên trong nƣớc cất)
STT Chỉ tiêu
đánh giá Tiêu chuẩn
Số lƣợng mẫu (ống) Kết quả 1 Độ tan Tan đều thành hỗn dịch đồng nhất sau khi lắc nhẹ màu trắng đục, hông c tiểu phần l 20 Phù hợp 2 Tốc độ t o huyền dịch ≤ 60 gi y 20 34,6 ± 5,4 3 Thời gian lắng cặn 5 ± 2 phút 20 4,5 ± 0,5 4 pH 6 - 7 20 x 2 mẫu 6,87 ± 0 1
Kết quả trên cho thấy vắc xin tan tốt trong dung môi nƣớc cất Đánh giá về cảm quan vắc xin sau hoàn nguyên nhanh ch ng trở l i tr ng thái ban đầu giống nhƣ trƣớc hi đông hô thể hiện qua các giá trị về độ tan, tốc độ t o huyền dịch đồng nhất và thời gian lắng cặn. Vắc xin RaP01 c thành phần Hydroxyt nhôm một hợp chất rất nh y cảm với nhiệt độ thấp Trong quá trình đông hô vắc xin c pha đông b ng đƣa nhiệt độ của vắc xin xuống đến -70°C. Những tác động thay đổi nhiệt độ này rất dễ làm thay đổi cấu trúc của h t gel nhôm do đ ảnh hƣởng đến vắc xin. Tuy nhiên các ết quả đánh giá
đặc tính vật lý của vắc xin RaP01 đông hô sau hoàn nguyên cho thấy quá trình đông hô hông ảnh hƣởng đáng ể đến vắc xin.
Với 6 chỉ tiêu ở d ng đông hô và 4 chỉ tiêu ở d ng sau hoàn nguyên đƣợc đánh giá VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 đã thỏa mãn tất cả các yêu cầu về tiêu chuẩn vật lý theo tiêu chẩn cơ sở đề xuất cho một vắc xin đông hô n i chung và VXMC ho gà vô bào n i riêng
3.1.5. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu hóa học
Các thành phần h a học trong vắc xin RaP01 gồm c : chất hấp phụ nhôm Al(OH)3, chất bảo quản Merthiolate là 2 thành phần trong công thức của vắc xin Ngoài ra trong vắc xin còn một lƣợng NaCl là thành phần của dung dịch đệm và Formaldehyde là chất bất ho t háng nguyên độc tố ho gà (PT), một thành phần trong háng nguyên tinh chế aP còn tồn dƣ Tất cả các thành phần h a học này đều đƣợc kiểm tra trong ống vắc xin RaP01 và cho kết quả đ t yêu cầu theo tiêu chuẩn cơ sở đối với VXMC ho gà vô bào (bảng 3.4).
Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu về h a học của vắc xin RaP01
STT Chỉ tiêu Tiêu chuẩn
Kết quả Trƣớc đông khô Sau đông khô 1 Al3+ (mg/ml) ≤ 2,5 0,32 0,30 2 Methiolate (%) ≤ 0,02 0,0040 0,0038 3 NaCl (%) 0,7 - 1,0 0,89 0,92 4 Formaldehyde (%) ≤ 0,01 0,0012 0,0010
3.1.6. Kết quả xác định đặc tính kháng nguyên của vắc xin ho gà vô bào RaP01
Bảng 3.5. Kết quả xác định đặc tính háng nguyên của vắc xin RaP01
STT Chỉ tiêu
Kết quả
Trƣớc đông khô Sau đông khô
1 Hàm lƣợng Nitơ Protein (µg/ống) 25,65 23,45 2 Độ hấp phụ PT (%) 85,25 82,34 3 Độ hấp phụ FHA(%) 84,56 81,42 4 Ho t tính miễn dịch (IU/ống) 64,47 (38,52 - 110,56) 54,91 (25,77 - 98,59) Nhƣ vậy sau đông hô mức độ hấp phụ của cả 2 háng nguyên PT và FHA và ho t tính miễn dịch của vắc xin dƣờng nhƣ c giảm nhẹ c thể do ảnh hƣởng của các tác động vật lý làm cho các chỉ tiêu này sụt giảm so với trƣớc đông hô Tuy nhiên do số liệu nghiên cứu rất h n chế nên đ y mới chỉ là những nhận xét ban đầu để c cái nhìn tổng quát về chất lƣợng của lô vắc xin RaP01 c đáp ứng đƣợc tiêu chuẩn là ứng viên cho MCQG hay hông, ngh a là vắc xin đã đáp ứng tiêu chuẩn c ho t tính miễn dịch > 34 IU/ống nhƣ đƣợc đề xuất ban đầu.
3.2.KẾT QUẢ CHUẨN ĐỊNH ĐƠN VỊ MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN HO GÀ VÔ BÀO RaP01 GÀ VÔ BÀO RaP01
Kết quả kiểm định chất lƣợng của vắc xin ho gà vô bào RaP01 đông hô đã chứng minh vắc xin này đáp ứng đƣợc tất cả các yêu cầu của một ứng viên VXMC quốc gia Vì là ứng viên MCQG nên theo quy định, việc chuẩn độ xác định đơn vị ho t tính c trong 1 ống vắc xin RaP01 cần đƣợc xác định t i ít nhất 2 PTN đ i diện với tối thiểu 6 lần thực hiện độc lập ở mỗi PTN để đ t đƣợc các dữ liệu đủ độ tin cậy khi xử lý thống ê iểm định Đơn vị ho t tính
của vắc xin ho gà đƣợc biểu thị bằng ĐVMD c trong 1 đơn vị thể tích nhƣ trong 1 liều, 1 ml hay 1 ống. Số ĐVMD trong 1 ống vắc xin ho gà vô bào RaP01 sẽ đƣợc chuẩn độ so sánh với MCQT JNIH-3 (c 34 IU/ống) Quá trình chuẩn định hay còn gọi là “nối chuẩn” sẽ quyết định số ĐVMD biểu thị bằng IU c trong 1 ống vắc xin ho gà vô bào RaP01 Theo chỉ định của cơ quan kiểm định quốc gia đơn vị ho t tính của vắc xin ho gà vô bào dự tuyển MCQG RaP01 đƣợc chuẩn độ t i phòng iểm định IV C và hoa iểm định vắc xin vi khuẩn của NICVB. Kết quả chuẩn độ t i IV C đƣợc thể hiện ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả xác định ĐVMD của vắc xin RaP01 t i IVAC
Lần thực hiện
Ống vắc xin RaP01
Kết quả
ĐVMD (IU/ống) Khoảng tin cậy 95%
1 01 71,28 45,64 - 132,56 02 50,23 35,15 - 90,46 03 54,91 37,90 - 99,82 2 04 82,15 51,79 - 145,32 05 54,75 37,38 - 99,5 06 76,81 48,45 - 143,62 3 07 54,91 37,55 - 95,82 08 70,40 45,2 - 130,8 09 80,90 50,45 - 151,8 4 10 79,37 49,68 - 148,74 11 84,70 52,38 - 129,35 12 85,23 52,61 - 120,46
5 13 81,40 50,7 - 152,8 14 70,00 42,24 - 130 15 48,60 34,3 - 87,24 6 16 79,20 49,61 - 148,4 17 65,75 42,75 - 121,52 18 51,00 35,5 - 92,54 GM 67,71 45,64 - 121,84 SD 13,62
Qua 6 lần chuẩn độ với mẫu chuẩn JNIH-3 thu đƣợc 18 số liệu cho kết quả số ĐVMD của 1 ống vắc xin ho gà RaP01 đông hô đ t trung bình 67,71 IU/ống giá trị thấp nhất là 48 60 IU/ống và cao nhất là 85 23 IU/ống; SD = 13,62 IU, khoảng GM ± 2SD từ 45,64 – 121,84 IU.
Trong hi đ t i NICVB, kết quả chuẩn độ ĐVMD của vắc xin ho gà RaP01 với 7 lần thực hiện so sánh với mẫu chuẩn JNIH-3 c giá trị trung bình là 76 28 IU/ống. Kết quả chuẩn độ ở NICVB cho thấy tất cả các lần chuẩn độ đều c giá trị công hiệu nằm trong khoảng GM ± 2SD (24,55 – 128,01 IU) với SD = 25,866 IU.
Nhìn chung tất cả các ết quả chuẩn độ t i IV C và NICVB đều cho giá trị ĐVMD trong 1 ống vắc xin RaP01 cao hơn 34 IU/ống dù đƣợc tính đến khoảng dao động GM ± 2SD Giá trị trung bình ĐVMD của vắc xin RaP01 chuẩn độ t i NICVB cao hơn so với kết quả chuẩn độ t i IV C nhƣng mức độ dao động là cao hơn thể hiện qua SD và CV giữa các lần thực hiện (Hình 3 8).
Hình 3.8. Số ĐVMD trung bình của 1 ống vắc xin ho gà RaP01 đông hô chuẩn độ t i IV C và NICVB
Từ các ết quả chuẩn độ nối chuẩn với MCQT của 2 PTN (IV C và NICVB), ĐVMD của VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 đƣợc xử lý thống ê và công bố là 72 IU/ống (theo quyết định số 612/QĐ-KĐQG).
3.3.KẾT QUẢ NGHI N CỨU TÍNH N ĐỊNH CỦA VẮC XIN HO GÀ RaP01
3.3.1. Tính ổn định ở nhiệt độ bảo quản
3.3.1.1.Tính ổn định về công hiệu ở nhiệt độ -40°C ± 2°C và 5°C ± 3°C
Ở nhiệt độ bảo quản -40°C ± 2°C vắc xin RaP01 đƣợc theo dõi công hiệu t i 5 mốc thời gian là 1 tháng 2 tháng 3 tháng 6 tháng và 9 tháng Kết quả đƣợc chỉ ra ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Công hiệu của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ bảo quản (-40°C ± 2°C) Thời gian (tháng) ĐVMD (IU/ống) TB (IU/ống) SD CV%
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
1 72,54 74,52 73,56 73,54 0,99 1,3
2 77,56 74,25 76,54 76,12 1,7 2,2
3 68,50 76,58 78,56 74,55 5,3 7,1
6 75,25 72,34 71,45 73,01 2,0 2,7
9 74,58 76,54 68,54 73,22 4,2 5,7
Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn công hiệu của VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 ở -40°C ± 2°C
Nhƣ vậy đối với nhiệt độ -40°C ± 2°C sau 9 tháng công hiệu của vắc xin là hông thay đổi, so với số ĐVMD trong 1 ống VXMC dự tuyển ho gà
73.540 76.117 74.547 73.013 73.220 60.000 65.000 70.000 75.000 80.000 85.000 90.000 1 2 3 6 9 IU /ốn g