2. Nội dung chi tiết của đề cương luận văn thạc sĩ
1.6. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT SINH KHỐI VKTQH TẠI VIỆT NAM VÀ
TRÊN THẾ GIỚI
1.6.1.Tình hình sản xuất sinh khối VKTQH trên thế giới
Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về chế biến và sản xuất sinh khối VKTQH ứng dụng trên quy mô lớn [37, 38]. VKTQH được sản xuất dưới dạng chế phẩm sinh học chủ yếu ở hai dạng: bột (thường là tế bào khô) dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi [34] và sản phẩm dạng lỏng (tế bào sống) chủ yếu được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi và nước nuôi trồng thủy sản. Tại Bỉ, sinh khối VKTQH dạng bột cũng đã được ứng dụng làm phân bón hữu cơ và cho kết quả khả quan đối với việc sản xuất cà chua [39], pakchoi [40], rau bina [41],…Tại Trung Quốc, Qi và cộng sự đã công bố rằng các chế phẩm sinh học được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản chủ yếu là vi khuẩn quang hợp và vi khuẩn đối kháng vi sinh vật gây bệnh [42]. Ở Úc, năm 2019 Delamare-Deboutteville và các cộng sự đã nghiên cứu sản xuất và chế
biến sinh khối VKTQH làm thức ăn cho cá vược châu Á với nhu cầu năng lượng cao từ protein. Sinh khối được thu họach và bảo quản trong tủ đông (- 200C) trước khi làm khô bằng máy sấy thực phẩm thương mại ở 45 C cho đến khi khô (19,5 giờ). Sinh khối khô được tiếp tục xử lý trong máy trộn (Nutribullet 600, Australia) để tạo ra bột mịn và đồng nhất. Sau khi thu thập tổng cộng 2,2 kg sinh khối khô được phân lập từ nước thải tổng hợp, sinh khối vi khuẩn được phân tích để xác định hàm lượng protein, chất béo, axit amin, tổng số carotenoid, phốt pho,…[35].
1.6.2.Tình hình nghiên cứu và sản xuất sinh khối VKTQH tại Việt Nam
Ở nước ta, VKTQH đã bắt đầu được chú trọng trong các nghiên cứu phân loại. Những nghiên cứu về khả năng loại bỏ sulfide trong đáy ao nuôi trồng thủy sản, nhóm tác giả Võ Thị Hạnh và cộng sự đã nghiên cứu tạo chế phẩm VEM dựa trên quy trình sản xuất chế phẩm EM của Nhật. Chế phẩm này ngoài chủng loại và số lượng vi sinh vật có trong chế phẩm EM còn có thêm các loài vi khuẩn Bacillus spp và VKTQH có nguồn gốc từ
Trung Quốc (Rhodobacter và Rhodococcus). Lê Thị Thúy Ái và cộng sự
(2004) đã phân lập được 5 chủng VKTQH từ nhiều thủy vực khác nhau có khả năng chuyển hóa amoni, sulfide và hữu cơ trong quá trình xử lý nước thải chế biến hải sản. Kết quả hỗn hợp các chủng vi khuẩn này loại bỏ được sulfide, BOD, COD đến xấp xỉ nước thải loại B, amoni được loại bỏ gần như hoàn toàn.
Hơn hai mươi năm, qua tại phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học, đối tượng VKTQH đã và đang được chú trọng tìm kiếm, thu nhận để ứng dụng vào các lĩnh vực khác nhau như: xử lý nước thải đậm đặc hữu cơ [43], phân hủy các hydrocarbon mạch vòng [44], thu nhận các hoạt chất sinh học có giá trị [45]. Đặc biệt, ứng dụng vi khuẩn tía quang hợp trong ao nuôi trồng thủy sản đã được quan tâm nghiên cứu. Hiện nay, các chế phẩm của phòng chủ yếu ở dạng dịch. Tuy nhiên, việc vận chuyển chế
phẩm dạng dịch đến những vùng nuôi trồng thủy sản còn gặp nhiều khó khăn vì nước ta có khoảng hơn 3000 km đường bờ biển và nghề nuôi trồng thủy sản chủ yếu tập trung tại các tỉnh ven biển, do vậy, chế phẩm VKTQH ở dạng dịch sản xuất tại Viện Công nghệ sinh học gặp khó khăn trong quá trình vận chuyển và phân phối tới các vùng NTTS trong cả nước. Vì vây, cần được nghiên cứu để tạo chế phẩm VKTQH dạng đậm đặc hơn để dễ dàng vận chuyển, giảm giá thành phù hợp với nhu cầu thực tế của người dân nuôi trồng thủy sản là việc làm rất cần thiết để phát triển bền vững nghề nuôi tôm phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu.
1.7.CARRAGEENAN VÀ ỨNG DỤNG
Carrageenan là một polysaccharide của galactose-galactan. Ngoài mạch polysaccharide chính còn có thể có các nhóm sulfate được gắn vào carrageenan ở vị trí và số lượng khác nhau. Carrageenan không phải là một polysaccharide đơn lẻ, có cấu trúc nhất định mà carrageenan nói chung là một galactan sulfate.
Carrageenan được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm với các tính chất như tạo gel, làm dày, ổn định. Carrageenan như một chất làm đông, một chất nhũ tương giúp đồng nhất các dung dịch ở trạng thái hỗn hợp [46].
Trong mỹ phẩm, thuốc đánh răng: Các sản phẩm ứng dụng từ carrageenan
bao gồm kem đánh răng, chất dưỡng tóc, nước gội đầu, nước hoa, kem dưỡng da... Thuốc đánh răng là hỗn hợp phức của các thành phần vô cơ và hữu cơ được huyền phù trong một pha liên tục, i-carrageenan được thêm vào để ngăn chặn sự phân tách của pha lỏng và pha rắn. Tính chất và chức năng của carrageenan được phản ánh bởi sự tương tác với các thành phần khác, như chất mang màu, canxi carbonate, dicanxi phosphate và silicate [46].
Trong công nghiệp thực phẩm: Carrageenan là một trong những chất phụ
gia tốt nhất trong công nghiệp thực phẩm, là chất ổn định hóa hệ nhũ tương của hỗn hợp protein và chất béo trong thịt, tạo cảm giác mềm, dịu của sản phẩm. Các
nhà sản xuất thường sử dụng là chất tạo sánh trong nước giải khát, tạo độ mềm xốp trong bánh mỳ, sản xuất giấy, chế biến sữa, làm bánh kẹo [46].
Trong y, dược học: Carrageenan có khả năng chống kháng bổ trợ, hạn
chế phát triển huyết khối, chống đông tụ, hạn chế u xơ, chống xơ vữa động mạch, ức chế hoạt động của virus... có khả năng cố định men pepsin để bảo vệ các vết loét và làm cho các vết loét mau lành [47].
Trên cơ sở những nghiên cứu trên, Với những tính năng ưu việt của chế phẩm VKTQH mang lại và để giải quyết vấn đề vận chuyển và phân phối chế phẩm VKTQH chúng tôi muốn phát triển chế phẩm VKTQH dạng dịch thành chế phẩm dạng lỏng sệt thuận tiện và có giá thành phù hợp để ứng dụng xử lý môi trường ao nuôi trồng thủy sản, làm thức ăn cho con giống hai mảnh vỏ.
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ, MÁY MÓC
2.1.1. Vật liệu
Các chủng VKTQH Rhodopseudomonas sp. 311, Rhodobacter sp.
NDT6, Rhodobacter sp. 86 và Rhodopseudomonas sp. 517 (được phân lập từ vùng ven biển Nam Định, Thanh Hóa) đã được tuyển chọn có giá trị dinh dưỡng cao nhất. Chúng đã được nghiên cứu kỹ các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và vị trí phân loại cũng như các điều kiện tối ưu như nhiệt độ, pH, nồng độ muối và cường độ ánh sáng trên môi trường cơ bản cho VKTQH sinh trưởng.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng đều là hóa chất ngoại nhập của hãng Sigma, Merk, Trung Quốc và Việt Nam sản xuất.
2.1.3. Môi trường
Môi trường nuôi cấy VKTQH không lưu huỳnh trong phòng thí nghiệm là môi trường DSMZ 27 bao gồm các thành phần sau: cao nấm men (0,3 g/l), succinate - Na (1 g/l), acetate (0,5 g/l), K2HPO4 (1g/l), KH2PO4 (0,5 g/l), MgSO4.7H2O (0.4 g/l), CaCl2.2 H2O (0,05 g/l), NH4Cl (0,4 g/l), vi lượng SL6(*) (1 ml/l), dung dịch vitamin B12(**)(0,4 ml/l), Nước cất (1000 ml), NaCl (20 g/l), pH (6,8).
Dung dịch vi lượng SL6(mg/l): HCl (25%) 6,5 ml; FeCl2.4H2O 1,5 g; H3BO3 0,3 g; MnCl2.2H2O 0,03 g; CoCl2.6H2O 0.2 g; ZnSO4. 7H2O 0,1 g; CuCl2.2H2O 17 mg; NiCl2.6H2O 24 mg; Na2MoO4.2H2O 36 mg, H2O 993 ml.
Dung dịch vitamin B12: 10 mg trong 100 ml nước được khử trùng bằng
màng lọc và bổ sung vào môi trường trước khi sử dụng.
Sử dụng môi trường DSMZ 27 cải tiến có bổ sung 1,4 gGlutamat và 0,6 g Malatethay succinate - Na (1 g/l); acetate (0,5 g/l).
Dung dịch Bradford: Hòa tan 100 mgCoomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) trong 50 ml ethanol 96%, thêm 100 ml H3P0485%, bổ sung nước cất vừa đủ 1000 ml; dung dịch đệm lysis: 9 g NaCl và 12 g NaOH hòa tan trong nước cất đến thể tích cuối cùng là 1000 ml; dung dịch chuẩn BSA (albumine huyết thanh bò) 100 mg/l.
2.1.4. Các thiết bị máy móc
Các thiết bị máy móc được sử dụng bao gồm thiết bị của Phòng Công nghệ sinh học môi trường Viện Công nghệ sinh học. Các thiết bị bao gồm:
Tên thiết bị, máy móc Xuất xứ
Tủ nuôi cấy vi sinh Binder, infors, Đức
Bình khí nitơ Nga
Máy quang phổ NOVASPEC II Anh
Máy quang phổ UV - 1650PC Shimazdu, Nhật Bản
Cân phân tích Mettler toldo Thụy Sỹ
Máy ly tâm lạnh CT15RE HiMac Hitachi
Máy Vortex Đức
Máy đo Ph Thommas Scientific, Mỹ
Máy lắc ổn nhiệt N-Biotex, Hàn Quốc
Bể ổn nhiệt N-Biotex, Hàn Quốc
Máy hút chân không Speed- Vac 110A Savant, Mỹ
Tủ lạnh thường GR-K22EA Toshiba
Tủ lạnh sâu -20 Alaska
Box cấy Biocyt ESI Flufrance Pháp
Kính hiển vi quang học Olympus Nhật Bản Chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử JEM1010 Nhật Bản
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Đánh giá sinh trưởng và xác định mật độ của VKTQH
Sinh trưởng của các chủng VKTQH được đánh giá bằng cách xác định độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào tại bước sóng 800 nm (OD800), vì trong tế bào VKTQH Bchl có cực đại hấp thụ ở 800 nm và độ hấp thụ này tỷ lệ với hàm lượng Bchl và do vậy tỷ lệ thuận với sinh khối của tế bào. Các chỉ số này được đo trên máy quang phổ Novaspec II hoặc máy quang phổ UV - 1650PC.
Mật độ được xác định theo phương pháp pha loãng như sau: mẫu được pha loãng liên tục bằng nước cất vô trùng từ 101 đến 1014. Dùng pipet vô trùng lấy 50 µl dung dịch ở các nồng độ thích hợp nhỏ lên bề mặt đĩa thạch chứa môi trường DSMZ 27. Dùng que gạt vô trùng dàn đều dịch đó trên mặt thạch. Đặt các đĩa thạch chứa mẫu VKTQH trong điều kiện khí quyển nitơ, dưới ánh sáng đèn sợi đốt 60w, tiến hành đếm số khuẩn lạc sau 5 -7 ngày.
Số lượng khuẩn lạc (CFU) xuất hiện trên đĩa được đếm và tính theo công thức: CFU/ml = a ×1/v×n
Trong đó: n là độ pha loãng mẫu, a là số khuẩn lạc đếm được trên bề mặt đĩa thạch, v là thể tích mẫu được cấy, 1/v thể tích mẫu qui về 1 ml.
Mật độ tế bào VKTQH còn được xác định theo phương pháp MPN.
2.2.2. Phương pháp nuôi vi khuẩn tía quang hợp làm thức ăn trong môi trường có bổ sung nguồn carbon khác nhau trường có bổ sung nguồn carbon khác nhau
VKTQH có khả năng sử dụng được nhiều nguồn carbon hữu cơ cho sinh trưởng. Để xác định khả năng sử dụng một số nguồn carbon cho sinh trưởng của 4 chủng VKTQH sử dụng làm thức ăn, chúng tôi đã nuôi cấy chúng trong môi trường DSMZ 27 dịch thể thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện kỵ khí sáng. Khả năng sinh trưởng của chúng được ghi nhận sau 5 ngày nuôi cấy.
Sinh khối VKTQH thu được ở cuối pha log được ly tâm ở các tốc độ vòng 8000 vòng/phút để thu sinh khối tích lũy được khi nuôi trên các nguồn carbon khác nhau.
2.2.3. Định lượng Protein bằng phương pháp Bradford
Các protein sẽ phản ứng với thuốc thử Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G-250) hình thành hợp chất màu xanh có khả năng hấp thụ ánh áng ở bước sóng 595 nm [48].
Tiến hành: Dịch nuôi cấy vi khuẩn được cho vào ống eppendorf ly tâm ở
8000 vòng/phút loại dịch nổi. Tủa được hòa lại trong đệm lysis và giữ ở bể ổn nhiệt ở 90oC trong 30 phút. Sau khi ly tâm 13000 vòng/phút (15) phút, 0,8 ml dịch nổi được bổ sung 0,2 ml thuốc thử Bradford, chờ 2 phút đo độ hấp thụ ở A595. Dựng đồ thị chuẩn protein từ dung dịch BSA 100 mg/l với các nồng độ 2, 4, 6, 8, 10 mg/l. Tính lượng protein tế bào có trong mẫu nghiên cứu dựa vào đồ thị chuẩn sử dụng albumine huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn.
2.2.4. Phương pháp nuôi cấy VKTQH không lưu huỳnh
Trong phòng thí nghiệm: VKTQH được nuôi trong ống thủy tinh có nắp đậy caosu hoặc trong các bình thủy tinh hình trụ có thể tích chứa dịch môi trường DSMZ 27. Môi trường trong các bình và các ống thủy tinh được sục khí nitơ qua màng lọc vô trùng thay thế khí oxy trong môi trường sao cho nồng độ oxy hòa tan 0 mg/l. Giống VKTQH được nuôi trong ống thủy tinh V= 12 ml hoặc bình thủy tinh V=100 ml chứa môi trường DSMZ 27 ở điều kiện kỵ khí, sáng và khi sinh trưởng của chúng ở pha log với mật độ tế bào khoảng 109CFU thì được cấy vào bình thí nghiệm khoảng 5 - 10% (v/v) để đạt mật độ ban đầu OD800 khoảng 0,1 và bổ sung hàm lượng sulfide là 10 mgS2-/l để theo dõi sinh trưởng và hoạt tính loại bỏ sulfide (xác định thông qua hàm lượng sulfide còn lại trong môi trường nuôi) của các chủng VKTQH.
Ngoài tự nhiên: VKTQH được nuôi trong các bể kính và bể nhựa với các thể tích khác nhau: 10ml, 50 ml, 100ml, 200ml. VKTQH được nuôi trên môi trường DSMZ 27 cải tiến có bổ sung1,4 g glutamat và 0,6 g malate.
2.2.5. Phương pháp thu sinh khối VKTQH
Phương pháp ly tâm
Ở phương pháp này sẽ sử dụng máy ly tâm với 6 tốc độ quay khác nhau: 3000 vòng/phút, 4000 vòng/phút, 5000 vòng/phút, 6000 vòng/phút, 7000 vòng/phút và 8000 vòng/phút trong 5 phút. 35ml mẫu được chuyển vào ống ly tâm 50ml. Khả năng tích lũy sinh khối (OD800) được kiểm tra trước và sau khi ly tâm để đo hiệu quả thu hoạch. Sau đó sinh khối VKTQH được hoà tan để thu được dung dịch đậm đặc. Dung dịch đậm đặc được nuôi cấy trong các bình thử nghiệm chứa môi trường DSMZ 27 lỏng cho đến khi OD800
khoảng 0,1- 0,2. Các bình thử nghiệm được nuôi cấy trong điều kiện yếm khí với ánh sáng đèn sợi đốt ở 5000 lux. Sự phát triển của dung dịch đậm đặc sinh khối ở các tốc độ khác nhau được theo dõi trong 5 ngày.
Phương pháp lắng tủa hóa học
Phương pháp này sẽ được thử nghiệm trên ba chất đông tụ hóa học, nhôm polyclorua, nhôm sunfat và sunfat sắt với những liều lượng khác nhau. Hỗn hợp VKTH trong nuôi cấy thử nghiệm (với ∆OD800 khoảng 2,0 - 2,5) được cho vào các bình 100 ml. Nồng độ nhôm sunphat, sắt sunphat được kiểm soát theo cấp độ từ 500 đến 4000 mg.L-1. Nồng độ nhôm polychloride được kiểm soát theo cấp độ từ 1000 đến 8000 mg.L-1 .Các bình sau đó được đặt trên máy lắc với tốc độ 100 vòng / phút trong 15 phút. Sau khi đông tụ, các mẫu được để lắng trong 60 phút. Sau khi lắng, 5 mL mẫu được thu thập từ giữa các bình và xác định phần trăm tế bào bị loại bỏ.
Phương pháp lắng tủa sinh học bằng tủa chitosan
Sinh khối VKTQH được nuôi trong môi trường DSMZ -27 cải tiến, nuôi ở điều kiện kỵ khí sáng, Hỗn hợp VKTH trong nuôi cấy thử nghiệm (với
∆OD800 khoảng 2,0 - 2,5) được cho vào các bình 100 ml. Nồng độ chitosan được kiểm soát theo cấp độ từ 50 đến 250 mg.L-1. Các bình sau đó cũng được đặt vào máy lắc với tốc độ 100 vòng/phút trong 15 phút. Sau khi đông tụ, các mẫu được để lắng trong 60 phút. Sau khi lắng, 5 mL mẫu được thu thập từ giữa các bình và xác định phần trăm tế bào bị loại bỏ.
Hiệu suất lắng tủa được tính theo công thức:
Hiệu suất lắng tủa = (ODban đầu – ODsau lắng)/ ODbanđầu x100%
2.2.6. Phương pháp tạo chế phẩm dạng lỏng sệt
Phương pháp tạo chế phẩm dạng lỏng sệt bằng tinh bột biến tính
Sinh khối sau khi thu hồi bằng phương pháp tủa chitosan được sử dụng tạo chế phẩm dạng lỏng sệt có bổ sung tinh bột biến tính. Tinh bột được hồ hóa ở trạng thái gel với tỷ lệ 2, 3, 4, 5% sau đó để nguội rồi tiến hành tạo chế phẩm VKTQH dạng lỏng sệt bằng cách bổ sung sinh khối thu được với các tỷ lệ 2VK:1TB, 1VK:1TB và tỷ lệ 1VK:2TB
Tinh bột biến tính được hồ hóa ở các nồng độ khác nhau sau đó được bổ sung sinh khối VKTQH sao cho mật độ ban đầu của chế phẩm khoảng 1014. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ tinh bột biến tính bổ sung thích hợp để tạo chế phẩm VKTQH dạng lỏng sệt. Sau khi tạo chế phẩm theo dõi mật độ tế bào trong 7 ngày.
Phương pháp tạo chế phẩm dạng lỏng sệt bằng CMC
Sinh khối sau khi thu hồi bằng phương pháp tủa chitosan được sử dụng