2. Nội dung chi tiết của đề cương luận văn thạc sĩ
3.3.2. Kết quả thu hoạch sinh khối theo phương pháp đông tụ
Đông tụ bằng nhôm polyclorua (PAC), nhôm sulfate và sắt sulfate
Để cải thiện phương pháp thu hoạch sinh khối, ở phương pháp này chúng tôi thí nghiệm trên ba chất lắng tủa hóa học là PAC, nhôm sulfate và sắt sulfate. Kết quả thể hiện Hình 3.13.
Hình 3.13.Tỷ lệ tách VKTQH ở các liều lượng chất lắng hóa học khác nhau
0 20 40 60 80 100 120 1000 2000 3000 4000 5000 6000 8000 PAC H iệu su ất lắ ng t ủa (%) Nồng độ chất đông tụ(mg/l) A 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 500 1000 1500 2000 2500 3000 4000 FeSO4 Al2(SO4)3 H iệu suấ t lắ ng t ủa Nồng độ chất đông tụ(mg/l) B
Kết quả thu được cho thấy cả ba chất đều có khả năng phân tách VKTQH từ môi trường nuôi một cáchhiệu quả. Nồng độ đông tụ tối ưu của PAC được xác định là 3000mg/l đạt hiệu suất 99,2%, nhôm sulfate là 1000mg/l đạt hiệu suất 80% và sắt sulfate với nồng độ 1000mg/l đạt hiệu suất 90%. Từ kết quả thí nghiệm, cho thấy rằng để đạt được hiệu suất lắng tủa lý tưởng thì nồng độ của các chất đông tụ phải trên 1000mg/l. Tuy nhiên khi sử dụng nồng độ hóa học cao để ứng dụng trong việc lắng tủa chế phẩm VKTQH thì đồng nghĩa với việc gây ô nhiễm thứ cấp và làm mất màu VKTQH. Do vậy việc sử dụng PAC, nhôm sulfate và sắt sulfate để thu sinh khối VKTQH cũng không khả thi. Hiện nay, Chitosan cũng là một chất đông tụ sinh học và thu được bằng cách khử kitin là thành phần chính trong vỏ của động vật giáp xác. Chitin là một polyme tự nhiên phong phú sau xenluloza trên thế giới có thể được sử dụng trong quá trình keo tụ [71]. Với ưu điểm về chi phí và thân thiện với môi trường nên chúng tôi đã tiếp tục tiến hành thí nghiệm thu sinh khối VKTQH bằng chitosan.
Đông tụ bằng Chitosan
Chitosan là một polyme tự nhiên có thể phân hủy sinh học với nhiều ưu điểm không độc hại [72]. Chitosan dễ dàng liên kết và tạo cầu nối để tạo ra các bông cặn lớn hơn, đặc hơn, làm cho chất rắn lơ lửng lắng xuống nhanh hơn. Vì vậy chitosan đã được khuyến khích sử dụng làm chất đông tụ vì nó không độc, không ăn mòn và an toàn khi xử lý. Thí nghiệm được tiến hành với mật độ VKTQH (∆OD800 2-2,5); Thời gian để lắng là 30 phút, nồng độ chitosan từ 50-250mg/l. Kết quả thu được thể hiện tại Hình 3.14.
Hình 3.14.Tỷ lệ tách VKTQ ở các liều lượng chitosan khác nhau A và B
0 20 40 60 80 100 120 50 100 150 200 250 Nồng độ Chitosan (mg/l) H iệu suấ t lắ ng t ủa ( %)
Hình 3.14 cho thấy với các nồng độ chitosan khác nhau đã ảnh hưởng đến khả năng lắng tủa tế bào VKTQH. Ở nồng độ 50-100 mg/l tỷ lệ phân tách đạt 70-90%, với nồng độ 150-250mg/l thì tế bào VKTQH đã lắng tủa hoàn toàn. Điều này cho thấy rằng tỷ lệ lắng tủa cải thiện khi tăng nồng độ chitosan. Tiếp tục theo dõi và so sánh hiệu suất lắng tủa sinh khối ở 150mg/l và ở 200-250mg/l thì tỷ lệ lắng tủa đạt 95-97% và không có sự khác biệt đáng kể (P> 0,05). Điều đó cho thấy rằng với nồng độ chitosan tối thiểu là 150mg/l thì tế bào VKTQH có tỷ lệ lắng tủa tốt. Các cơ chế liên quan đến sự lắng tủa này là sự hấp phụ và trung hòa điện tích. Chitosan có mật độ điện tích cation cao, trong khi điện tích tổng thể của các tế bào VKTQH là âm. Chitosan có khả năng trung hòa điện tích mạnh vì sự hấp phụ nhanh bắt nguồn từ điện tích dương. Lực hút giữa các điện tích cải thiện tần số va chạm của các hạt, dẫn đến sự hình thành lắng tủa [73].
Sau khi đông tụ các tế bào VKTQH bằng chitosan, các tập hợp tế bào lắng xuống đáy bình. Hiện tượng này xảy ra do sự trung hòa điện tích làm mất ổn định các tế bào VKTQH và biến các tế bào nhỏ thành tập hợp lớn. Do sự va chạm tế bào, các bông cặn được hình thành với nồng độ chitosan thấp hơn. Do đó, nồng độ chitosan tối ưu được xác định là 150mg/l, là nồng độ tối thiểu mà tại đó phần lớn các bông cặn lắng xuống đáy. Ahmad và cộng sự, 2011 đã báo cáo về việc thu hoạch tế bào vi tảo bằng cách đông tụ sử dụng chitosan và liều lượng tối ưu 10 ppm đã loại bỏ 99,0 ± 0,7% tế bào vi tảo. Farid và cộng sự, 2013 đã báo cáo việc sử dụng chitosan để thu thập vi tảo Nannochloropsis sp. với nồng độ tối ưu 100mg/l ở pH 10, sinh khối thu được cao nhất.
Tiếp tục thực hiện theo dõi thời gian lắng tối ưu được thử nghiệm với chitosan có nồng độ 150 mg/L, pH môi trường nuôi cấy, mật độ vi khuẩn tính theo ∆OD800 từ 2,0 - 2,5 và xác định thời gian lắng từ 0 - 50 phút. Kết quả được thể hiện cụ thể ở hình 3.15.
Hình 3.15.Ảnh hưởng của thời gian lắng đến hiệu suất thu hồi sinh khối
Hình 3.15 cho thấy rằng trong 5 phút đầu, khả năng lắng đạt gần 60%, tập hợp các tế bào tăng lên nhanh chóng. Sau 25-30 phút thì hiệu suất lắng đã đạt gần 97%, tiếp tục theo dõi sau 40-45 phút thì hiệu suất lắng dường như không thay đổi. Như vậy, chitosan cần thời gian lắng ít nhất là 30 phút để lắng tủa 97 ± 2% tế bào VKTQH.
Kết quả 3 phương pháp thu sinh khối (ly tâm, đông tụ hóa học và đông tụ sinh học) thì phương pháp ly tâm có tốc độ tối ưu là 4000 vòng/phút trong 10 phút nhưng với phương pháp này thì khó thu hoạch sinh khối với khối lượng lớn. Phương pháp đông tụ hóa học được sử dụng là PAC, nhôm sulfate và sắt sulfate. Liều lượng được xác định là 3.000, 1.000, 1.000 mg/l lần lượt với PAC, nhôm sulfate và sắt sulfate. Liều lượng của chất lắng tủa hóa học phải trên 1.000 mg/l. Do đó chất lắng tủa hóa học có thể gây ô nhiễm môi trường và làm biến đổi màu VKTQH. Chitosan được biết đến là một chất có hiệu quả trong việc lắng tủa các tế bào VKTQH trong môi trường nuôi cấy. Chitosan loại bỏ thành công 97,0 ± 2% tế bào VKTQH không lưu huỳnh ở nồng độ 150 mg/l, thời gian lắng 30 phút. Có thể coi đây là phương pháp và là tỷ lệ tối ưu để thu sinh khối VKTQH không lưu huỳnh. Sau khi thu được tối đa sinh khối VKTQH chúng tôi tiến hành tạo chế phẩm dạng lỏng sệt, với mục đích mật độ tế bào VKTQH phải được phục hồi hoàn toàn sau tạo chế
0 20 40 60 80 100 120 5 10 15 20 25 30 40 50 P hầ n t ră m lo ại bỏ ( %) Thời gian lắng (phút)
phẩm và dễ vận chuyển, chúng tôi tiến hành thí nghiệm tạo chế phẩm VKTQH dạng lỏng sệt bằng tinh bột biến tính.
3.4.TỐI ƯU PHƯƠNG PHÁP TẠO CHẾ PHẨM VKTQH DẠNG LỎNG SỆT 3.4.1.Tạo chế phẩm VKTQH dạng lỏng sệt bằng tinh bột biến tính
3.4.1.1.Kết quả ảnh hưởng của nồng độ tinh bột biến tính đến khả năng tạo chế phẩm dạng lỏng sệt
Với mục đích tạo gel để sản xuất chế phẩm VKTQH dạng lỏng sệt, chúng tôi tiến hành thí nghiệm hồ hóa tinh bột ở các nồng độ 2, 3, 4, 5(%). Kết quả cho thấy ở 2% nồng độ tinh bột biến tính tạo gel dạng lỏng, từ 3 – 5% khả năng tạo gel của tinh bột khá tốt. Trước khi hồ hóa tinh bột biến tính thì ở nồng độ cao nhất như 5% tinh bột khoai cũng chưa tạo ra dạng gel. Khi hồ hóa bằng nhiệt độ thì chỉ duy nhất nồng độ 2% tạo gel ở trạng thái lỏng hơn. Đối với tinh bột biến tính (bột ngô hoặc khoai) tạo gel ở nồng độ từ 3- 5%. Như vậy, nồng độ tinh bột biến tính có ảnh hưởng đến độ tạo gel trước và sau khi hồ hóa tinh bột (Hình 3.16).
Hình 3.16.Hình ảnh hồ hóa tinh bột ở các nồng độ khác nhau
Kết quả cho thấy ở tỷ lệ 2VK:1TB không tồn tại ở trạng thái lỏng sệt ngay cả ở nồng độ tinh bột cao là 5%. Ở tỷ lệ 1VK:2TB chế phẩm tạo thành ở dạng lỏng sệt từ nồng độ 3%, tuy nhiên, mật độ tế bào bị pha loãng và màu sắc không đậm đặc như mong muốn. Với tỷ lệ 1:1 chúng tôi thu được chế
phẩm VKTQH ở dạng lỏng sệt từ nồng độ 3%, mật độ tế bào thu được 1014
CFU/g. Kết quả được thể hiện trên Hình 3.17
Hình 3.17.Chế phẩm vi khuẩn tía dạng lỏng sệt tạo thành khi hồ hóa tinh bột 3.4.1.2.Kết quả đánh giá mật độ chế phẩm lỏng sệt
Chế phẩm tạo thành được đánh giá mật độ và pH trong thời gian 1 tuần ở các điều kiện lạnh để bảo quản và điều kiện nhiệt độ phòng có chiếu sáng để phục hồi. Về cảm quan, khi chế phẩm để ở điều kiện nhiệt độ phòng có chiếu sáng thì chế phẩm lỏng sệt không còn tạo gel như ban đầu mà có hiện tượng lắng tủa, sau 1 tuần màu sắc nhạt dần đi và có hiện tượng lên men làm pH môi trường axit hóa. Đối với chế phẩm bảo quản trong điều kiện lạnh màu sắc của chế phẩm cũng nhạt dần và quan sát thấy hiện tượng lên men tinh bột nhưng chậm hơn điều kiện nhiệt độ phòng (Hình 3.18).
Hình 3.18.Hình ảnh chế phẩm lỏng sệt sau 1 tuần nuôi ở điều kiện chiếu sáng
5% TB 4% TB; 3% TB 2% TB; ĐC
Hình 3.19.Mật độ tế bào VKTQH của chế phẩm lỏng sệt (tạo sệt bằng tinh bột) theo dõi sau 7 ngày ở nhiệt độ phòng
Hình 3.20.Mật độ tế bào VKTQH của chế phẩm lỏng sệt (tạo sệt bằng tinh bột) theo dõi sau 7 ngày ở nhiệt độ lạnh
Sau 7 ngày theo dõi, kết quả cho thấy mật độ tế bào của chế phẩm dạng lỏng sệt ở điều kiện nhiệt độ thường giảm nhanh hơn ở điều kiện bảo quản lạnh. Chế phẩm VKTQH dạng lỏng sệt được tạo ra từ tinh bột biến tính ở điều kiện nhiệt độ phòng hay điều kiện bảo quản lạnh đều thấy xu hướng giảm hơn so với lô đối chứng, cụ thể ở điều kiện nhiệt độ thường và điều kiện bảo quản lạnh thì mật độ tế bào đạt khoảng 1012 đến 1013 CFU/ml, trong khi đó ở lô đối chứng mật độ tế bào là 1014CFU/ml. Điều đó cho thấy việc bổ sung tinh bột biến tính tạo gel có ảnh hưởng đến mật độ tế bào trong chế phẩm. Do vậy cần
11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 5%TB 4%TB 3%TB 2%TB Đ/C
Bảo quản ở nhiệt độ lạnh
M ật đ ộ tế b àoVK T QH (log CF U )
Chế phẩm lỏng sệt bổ sung nồng độ tinh bột khác nhau
To 7 ngày 0 2 4 6 8 10 12 14 16 5%TB 4%TB 3%TB 2%TB Đ/C Mậ t độ t ế bà o VK TQ H (log C F U) Chế phẩm lỏng sệt bổ sung các nồng độ tinh bột khác nhau To 7 ngày
tìm kiếm cơ chất khác để tạo dạng gel phù hợp duy trì được mật độ và trạng thái sống của tế bào. Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tạo gel tạo chế phẩm dạng lỏng sệt bằng CMC.
3.4.2.Kết quả tạo chế phẩm VKTQH dạng lỏng sệt bằng CMC 3.4.2.1.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ CMC
Carboxymethyl cellulose (CMC) thường được sử dụng làm chất kết dính do khả năng liên kết của chúng. CMC làm giảm khả năng hòa tan thức ăn, làm mềm thức ăn viên và làm tăng độ nhớt của đường tiêu hóa, giảm chiều dài vi nhung mao đường ruột và hoạt động của các enzym tiêu hóa của cá. CMC có thể áp dụng để bổ sung vào thức ăn nhằm cải thiện chất lượng thức ăn và không có tác động tiêu cực đến năng suất tăng trưởng của cá chép. [74]
Trong nghiên cứu tại chết phẩm lỏng sệt, ở nồng độ 1%, 2%, 3% thì CMC đều có khả năng tạo gel, trong đó khả năng tạo gel ở nồng độ 1% là lỏng nhất. Và khi tạo gel bằng CMC không cần nhiệt độ cao để tạo gel như các sản phẩm phụ gia khác mà chỉ cần hoà tan trong nước nguội (Hình 3.21).
Hình 3.21.Hình ảnh tạo gel CMC ở các nồng độ khác nhau
Sau khi tạo gel, tiến hành tạo chế phẩm VKTQH dạng lỏng sệt bằng cách bổ sung sinh khối thu được với các tỷ lệ 2VK:1CMC, 1VK:1CMC và tỷ lệ 1VK:2CMC đối với các nồng độ CMC tạo gel. Kết quả cho thấy ở tỷ lệ 2VK:1TB thì ngay cả ở nồng độ CMC cao 3% chế phẩm VKTQH tạo thành không tồn tại ở trạng thái lỏng sệt. Ở tỷ lệ 1VK:2CMC chế phẩm tạo thành ở
1%CMC 2%CMC 3%CMC 3%CMC
dạng lỏng sệt từ nồng độ 2%, tuy nhiên, mật độ tế bào bị pha loãng và màu sắc không đậm đặc như mong muốn. Với tỷ lệ 1:1 chúng tôi tạo được chế phẩm VKTQH ở dạng lỏng sệt ở các nồng độ khác nhau, kết quả cho thấy: Với nồng độ CMC 1% chế phẩm lỏng sệt tạo thành dạng lỏng nhất chưa tạo dạng lỏng sệt, từ nồng độ 2% CMC thu được chế phẩm VKTQH dạng lỏng sệt với mật độ tế bào thu được sau khi tạo chế phẩm là1014 CFU/ml. Kết quả được thể hiện trên Hình 3.22.
Hình 3.22.Chế phẩm vi khuẩn tía dạng lỏng sệt tạo thành khi tạo gel bằng CMC ở các nồng độ khác nhau (Đ/C: sinh khối VKTQH thu được
sau khi tủa bằng chitosan) 3.4.2.2.Đánh giá mật độ chế phẩm lỏng sệt
Cũng được đánh giá mật độ tế bào trong 7 ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng có chiếu sáng để phục hồi và trong điều kiện lạnh để bảo quản thì thấy chế phẩm tạo thành không còn tạo gel như ban đầu, màu sắc nhạt dần và có hiện tượng lắng tủa, tách pha. Ở chế phẩm bảo quản trong điều kiện lạnh cũng quan sát thấy hiện tượng lắng tủa, màu sắc của chế phẩm cũng nhạt dần, mật độ tế bào khoảng 1013 CFU/ml trong khi ở lô đối chứng ở cả 2 điều kiện là 1014 CFU/ml. Cụ thể được thể hiện trên Hình 3.23, Hình 3.24 và Hình 3.25.
Hình 3.23.Hình ảnh chế phẩm lỏng sệt tạo thành bằng CMC sau 1 tuần nuôi ở điều kiện chiếu sáng
Hình 3.24.Mật độ tế bào VKTQH của chế phẩm lỏng sệt (tạo sệt bằng CMC) theo dõi sau 7 ngày ở nhiệt độ phòng
Hình 3.25.Mật độ tế bào VKTQH của chế phẩm lỏng sệt (tạo sệt bằng CMC) theo dõi sau 7 ngày ở nhiệt độ lạnh
10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 3%CMC 2%CMC 1%CMC Đ/C Mậ t độ t ế bà o VK TQ H (log C F U) Chế phẩm lỏng sệt bổ sung các nồng độ CMC khác nhau To 7 ngày 10 10.511 11.512 12.513 13.514 14.515 3%CMC 2%CMC 1%CMC Đ/C Mậ t độ t ế bà o VK TQ H (log C F U) Chế phẩm lỏng sệt bổ sung các nồng độ CMC khác nhau To 7 ngày 1%CMC 2%CMC 3% CMC Đ/C
Kết quả theo dõi mật độ VKTQH trong chế phẩm lỏng sệt tạo ra từ các nồng CMC khác nhau, ở điều kiện nhiệt độ phòng có chiếu sáng và ở điều kiện bảo quản lạnh cho thấy mật độ tế bào đều giảm hơn so với đối chứng. Trong đó, mật độ tế bào của chế phẩm dạng lỏng sệt ở điều kiện nhiệt độ thường giảm nhanh hơn ở điều kiện lạnh, cụ thể nằm trong khoảng 1013
CFU/ml, ở lô đối chứng là khoảng 1014 CFU/ml. Do vậy, CMC vẫn chưa phải cơ chất tạo gel tạo chế phẩm VKTQH dạng dỏng sệt mà chúng tôi cần tìm. Để có được chất tạo gel tối ưu cho sinh khối VKTQH, chúng tôi tiếp tục thí nghiệm trên Carrageenan, một chất phụ gia có nguồn gốc từ rong biển.
3.4.3.Kết quả tạo chế phẩm VKTQH dạng lỏng sệt bằng Carragenan 3.4.3.1.Kết quả lựa chọn nồng độ carrageenan thích hợp để tạo chế phẩm dạng lỏng sệt
Carrageenan như một chất kích thích miễn dịch đối với sự tăng trưởng, tỷ lệ sống và khả năng sử dụng thức ăn của cá chép. Carrageenan được kết hợp ở mức 0,5% và 1,0% trong chế độ ăn 30% protein. Cá chép được cho ăn