2. Nội dung chi tiết của đề cương luận văn thạc sĩ
3.2.2. Xây dựng quy trình nhân giống VKTQH ở điều kiện tự nhiên
Để khả thi về mặt kinh tế, xây dựng quy trình nhân nuôi giống vi khuẩn ngoài tự nhiên để có năng suất sinh khối tối đa, chúng tôi đã nuôi cấy các chủng chọn lựa trong các bình nuôi có thể tích 10 lit là bình nhựa trong và 50, 100 và 200 lit là bể kính, sử dụng môi trường cải tiến có bổ sung Mg2+ khử trùng bằng chlorine B và 15% giống. Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện chiếu sáng tự nhiên, so sánh với bình 10 lit trong điều kiện chiếu sáng bằng đèn sợi đốt 60 w (24/24 h), nhiệt độ ngoài trời dao động 30 - 37oC. Kết quả theo dõi động thái sinh trưởng của chúng được trình bày ở Hình 3.8.
Hình 3.8.Mức độ tích lũy sinh khối của hỗn hợp chủng giống vi khuẩn quang hợp trong các mô hình nuôi ở điều kiện tự nhiên
0 0.5 1 1.5 2 2.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 OD 8 0 0
Thời gian (ngày)
Bình 10 lit chiếu đèn Bình 10 lit tự nhiên
Bể 50 lit Bể 100 lit
Kết quả thí nghiệm cho thấy, khi nuôi vi khuẩn ở các quy mô khác nhau từ nhỏ nhất (10 lit) đến lớn nhất (100 lit), đường cong biểu diễn động thái sinh trưởng của các chủng vi khuẩn đều có dạng tương đồng. Trong giai đoạn 2-3 ngày đầu, ánh sáng được xuyên qua nhiều trong khi VKTQH là loài sinh vật phát triển tốt trong điều kiện kỵ khí dưới ánh sáng [62-64] nên đường cong sinh trưởng thể hiện tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn đạt nhanh hơn khi nuôi ở quy mô nhỏ. So sánh hai bình 10 lít ở ngoài tự nhiên và trong phòng thí nghiệm, động thái sinh trưởng ở điều kiện tự nhiên chậm hơn so với khi nuôi bằng ánh sáng đèn sợi đốt trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, sau 9 – 10 ngày nuôi cấy, mức độ tích lũy sinh khối OD800 của hai bình nuôi hỗn hợp VKTQH tương đương nhau và đều đạt pha dừng (OD800 đạt khoảng 1,8) mật độ tương đương 1010 CFU/ml. Có thể đạt được tỷ lệ sinh khối cao khi bề mặt được chiếu sáng cao hơn so với thể tích [36]. Như vậy, để thuận tiện và phù hợp với từng điều kiện sản xuất sinh khối ngoài tự nhiên, có thể sử dụng các bình có thể tích khác nhau như 50 lit, 100 lit và 200 lit nhằm sản xuất giống ngoài tự nhiên mà mật độ tế bào trong dịch nuôi vẫn đảm bảo.
3.2.3.Kết quả nhân nuôi VKTQH trong các bể nuôi từ các vật liệu khác nhau để sản xuất sinh khối ở qui mô pilot.
Ngày càng có nhiều bằng chứng rằng việc phát triển thức ăn protein chất lượng cao, chi phí thấp là rất quan trọng cho sự thành công trong tương lai của ngành nuôi trồng thủy sản [65]. Nấm men được coi là chất thay thế tảo cho một số loài [66-69], nhưng cho đến nay việc sản xuất công nghiệp protein từ vi tảo và nấm men vẫn chưa được mở rộng. So với vi tảo và nấm men thì ngoài có thành phần dinh dưỡng cao thì VKTQH còn có khả năng kháng chất độc cao [19, 70]. Trong sản xuất sinh khối VKTQH vật liệu của các bể nuôi có ảnh hưởng đến sinh trưởng của VKTQH, các vật liệu khác nhau có khả năng hấp thụ ánh sáng khác nhau. Nhằm mục đích sản xuất sinh khối ngoài pilot, hỗn hợp chủng giống VKTQH được nuôi
trên môi trường chứa 1,4 g glutamat và 0,6 g malate trong hai bể thủy tinh và bể plastic có thể tích 100 lit ở điều kiện vi hiếu khí. Thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện tự nhiên, nhiệt độ khoảng 35 - 37o C, mức độ tích lũy sinh khối được theo dõi hằng ngày, kết quả theo dõi sinh trưởng điển hình của chúng thể hiện ở Hình 3.9.
Hình 3.9.Khả năng tích lũy sinh khối của VKTQH ở các bể nuôi khác nhau
Kết quả ghi nhận được cho thấy: khi nuôi ở điều kiện ngoài tự nhiên, chịu tác động của chu kỳ ngày, đêm và chịu tác động của thời tiết nên hỗn hợp VKTQH sinh trưởng chậm hơn khi nuôi trong điều kiện có chiếu sáng trong phòng thí nghiệm. Khi nuôi hỗn hợp ở bể bằng vật liệu thủy tinh (bể kính) thì động thái sinh trưởng nhanh hơn so với khi nuôi VKTQH trong bể có vật liệu plastic. Khi nuôi trên bể thủy tinh thì sau 9-10 ngày hỗn hợp VKTQH đạt mật độ cao (OD800 khoảng 1.5), trong khi đó khi nuôi ở bể plastic phải mất 15 ngày hỗn hợp VKTQH mới đạt được mật độ OD800
khoảng 1.5. Điều này giải thích bể bằng thủy tinh có thể hấp thụ được ánh sáng nhiều hơn so với bể plastic. Như vậy, để sản xuất sinh khối ngoài tự nhiên chúng tôi có thể sử dụng bể thủy tinh để nuôi hỗn hợp VKTQH, bên cạnh đó khi triển khai ở các cơ sở thủy sản để thuận tiện chúng tôi cũng có thể sử dụng vật liệu plastic và composit và bổ sung thêm hệ thống chiếu sáng vào ban đêm để VKTQH tích lũy sinh khối nhanh hơn.
3.3.TỐI ƯU PHƯƠNG PHÁP THU SINH KHỐI VKTQH KHÔNG LƯU HUỲNH
3.3.1.Kết quả thu hoạch sinh khối theo phương pháp ly tâm
Trong việc tạo chế phẩm từ VKTQH thì thu hoạch sinh khối là khâu vô cùng quan trọng. VKTQH có kích thước nhỏ, độ ấm điện cao nên rất khó trong việc thu hoạch mẫu. VKTQH thường được sản xuất dưới dạng chế phẩm sinh học chủ yếu ở dạng bột (thường là tế bào khô) được sử dụng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi [34] và sản phẩm lỏng (tế bào sống) chủ yếu được sử dụng làm thức ăn nuôi trồng thủy sản. Lọc và ly tâm là hai phương pháp thường được sử dụng để thu hoạch sinh khối VKTQH. Với mục đích thu hoạch tối đa sinh khối để tạo chế phẩm VKTQH dạng lỏng sệt chúng tôi tiến hành thu sinh khối bằng phương pháp ly tâm, với tốc độ thử nghiệm là 3000 đến 8000 vòng/phút trong 5 phút. Kết quả sinh khối thu được được thể hiện trên Hình 3.10.
Hình 3.10.Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến hiệu quả thu hoạch sinh khối VKTQH
Kết quả cho thấy hiệu suất thu sinh khối có xu hướng tăng dần với tốc độ từ 3000 vòng đến 8000 vòng/phút, hiệu suất thu sinh khối thấp nhất ở 3000 vòng/phút (75%) và cao nhất là 8000 vòng/phút đạt gần 100%. Tuy nhiên, theo dõi sự phục hồi sinh trưởng của dịch ly tâm sau 5 ngày nuôi, kết quả cho thấy hỗn hợp có khả năng phục hồi sinh trưởng cao nhất ở 3000 - 4000
0 20 40 60 80 100 120 3000 4000 5000 6000 7000 8000 H iệu su ất lắ ng ( %) Tốc độ ly tâm (vòng/phút)
vòng/phút với mật độ VKTQH ∆OD800 đạt 2,5 và giảm dần ở 5000 - 8000 vòng/phút (tương đương ∆OD800 đạt 2,3 xuống 1,7) (Hình 3.11). Điều đó cho thấy tốc độ ly tâm có ảnh hưởng tới sự phục hồi sinh trưởng và phát triển của sinh khối VKTQH.
Hình 3.11.Sự phát triển của dung dịch đậm đặc sinh khối ở các tốc độ khác nhau
Kết quả cho thấy chế phẩm VKTQH có thể phục hồi khá tốt khi ly tâm ở các tốc độ từ 3000 v/p – 8000 v/p, tuy nhiên, sự phục hồi sinh trưởng ở các tốc độ ly tâm khác nhau có sự khác nhau. Ở các tốc độ ly tâm thấp thì khả năng phục hồi sinh trưởng cao hơn. Kết hợp về khả năng thu hồi sinh khối và sự phục hồi sinh trưởng ở các tốc độ ly tâm khác nhau, chúng tôi chọn tốc độ ly tâm 4000 v/p cho thu hồi sinh khối tạo chế phẩm dạng lỏng sệt.
Sau khi lựa chọn tốc độ ly tâm 4000 v/p, tiến hành xác đinh thời gian ly tâm từ 5 – 20 phút. Kết quả thể hiện ở Hình 3.12.
Hình 3.12.Ảnh hưởng của thời gian ly tâm đến hiệu suất thu hồi sinh khối
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3000 4000 5000 6000 7000 8000 ∆O D8 00
Sự phát triển của dung dịch sinh khối đậm đặc ở tốc độ khác nhau 0 20 40 60 80 100 120 0 5 7 10 15 20 H iệu su ất lắ ng ( %) Thời gian (phút)
Thời gian ly tâm cho thấy hiệu suất lắng cao trong 10, 15, 20 phút, sự khác biệt là có ý nghĩa (p> 0,05). Như vậy, khi sử dụng phương pháp ly tâm để thu sinh khối VKTQH để tạo chế phẩm dạng lỏng sệt thì chúng tôi chọn ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là chi phí cao [36] và chỉ sử dụng được ở quy mô phòng thí nghiệm, trong khi chế phẩm sinh học tạo ra cần nhiều và dễ vận chuyển đến các vùng có ngành nuôi trồng thủy sản phát triển. Để thương mại hóa quy trình công nghiệp từ VKTQH chúng tôi đã tiếp tục tiến hành phương pháp đông tụ để thu sinh khối VKTQH ở quy mô lipot.