1.3.3.1. Nguyên liệu
Mức độ phá vỡ của môi: Việc phá vỡ tối đa cấu trúc tế bào nguyên liệu tạo điều kiện tiếp xúc triệt để của chất tan và dung môi.
Độ ẩm của vật liệu: Độ ẩm cao sẽ làm chậm quá trình khuếch tán và gây ra sự dính bết giữa các phân tử. Nước còn lại trong nguyên liệu sẽ liên kết protein và các chất háo nước khác, điều này ngăn chặn sự thấm của dung môi, làm chậm quá trình khuếch tán phân tử và đối lưu.
1.3.3.2. Dung môi
Độ phân cực của dung môi: Dung môi ít phân cực thì dễ hoà tan các chất không phân cực và khó hoà tan các chất có nhiều nhóm phân cực. Ngược lại, dung môi phân cực mạnh thì dễ hoà tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hoà tan các chất ít phân cực. Người ta phân loại dung môi dựa vào độ phân cực như sau:
Dung môi không phân cực: ether dầu hoả, xăng, hexan, heptan, benzen, toluen,...
Dung môi phân cực yếu và vừa: chloroform, diclorethan, aceton, ethyl acetat,...
Dung môi phân cực mạnh: nước, glycerin, các loại cồn có mạch cacbon ngắn (methanol, ethanol, isopropanol...)
Độ phân cực của một số dung môi được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 1. 1: Độ phân cực của các dung môi
Tên dung môi P
Hexan 0.0
Ether dầu hoả 2.9
Ethyl Acetate 5.3
Ethanol 8.8
Methanol 12.5
1.3.3.3. Tỷ lệ dung môi và nguyên liệu
Với khối lượng nguyên liệu ban đầu cố định, khi lượng dung môi gia tăng, quá trình chiết diễn ra nhanh chóng và lượng dầu còn lại trong bã sẽ giảm.
1.3.3.4. Nhiệt độ
Trong công thức tính hệ số khuếch tán của Einstein, khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán cũng tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên. Hơn nữa, khi tăng nhiệt độ thì độ nhớt của dug môi giảm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất.
Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ (hoạt chất) sẽ được hoà tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng thấp. Do đó, thời gian chiết ngắn sẽ không chiết được hết hoạt chất trong dược liệu, nhưng nếu thời gian chiết dài quá dịch chiết lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản.
1.4. Giới thiệu một số loài vi khuẩn và các phương pháp khảo sát khả năng kháng vi sinh vật[44]
1.4.1. Giới thiệu một số loài vi khuẩn
Khả năng kháng khuẩn của cao Lô hội đã được nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau (200; 400; 800; 1600 mg/ml) chống lại 5 chủng vi khuẩn gây bệnh bao gồm ba chủng Gram âm (Escherichia coli(E.coli) – ATCC 43895,Salmonella typhi
- ATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa - ATCC 9027); và hai chủng Gram dương (Staphylococus aureus - ATCC 6538,Bacillus cereus- VTCC 1005).
1.4.1.1. Escherichia coli
Escherich là người đầu tiên phát hiện ra loài vi khuẩn này trong quá trình điều trị và nghiên cứu về các trẻ bị bệnh tiêu chảy vào năm 1885. Vì loài này kí sinh trong ruột già (tiếng Latinh là colum), nên ông đặt tên nó là Bacterium coli (vi khuẩn coli). Ông báo cáo phát hiện này vào năm 1885, trong thuyết trình của mình nhan đề “Vi khuẩn đường ruột ở trẻ sơ sinh” cho Hiệp hội Hình thái và Sinh lý học. Đến năm 1886, sau 18 tháng nghiên cứu, ông cho xuất bản cuốn sách với tựa đề "Darmbakteriendes Säuglings und ihre Beziehungenzur Physiologie der Verdauung”.
Phân loại khoa học:
- Giới (Kingdom): Bacteria
- Ngành (Division): Proteobacteria - Lớp (Class): Gammaproteobacteria - Bộ (Order): Enterobacteriales - Họ (Family): Enterobacteriaceae - Giống (Genus):Escherichia - Loài (Species): E.coli
Chúng thường không gây bệnh, nhưng một số chủng có thể gây nên tiêu chảy và nhiễm trùng sinh mủ.
Hình 1. 21: Vi khuẩn Escherichia coli trên kính hiển
Khi quan sát dưới kính hiển vi, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng vi khuẩn
E.colicó hình que, chiều dài của chúng dao động từ 1 μm đến 5 μm. Một số loài có thể di chuyển bằng roi, một số ít thì ở yên một chỗ không có khả năng di động. Chúng không thể tạo bào tử như nhiều loại vi khuẩn khác.
Sinh trưởng ở 15 – 40℃nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 37℃, pH từ 6.4 – 7.4. Mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, trắng đục khoảng 2 – 3 mm.
Độc tố:
- Một số E. colisản sinh ra độc tố có tên là độc tố Shiga gây tiêu chảy và có thể dẫn đến bệnh nặng.
- Nhiễm STEC có thể gây ra hội chứng huyết tán tăng urê máu (HUS) có thể làm hư thận và các cơ quan khác. Hầu hết những người bị nhiễm STEC đều không tiến triển thành HUS, nhưng trẻ nhỏ và người cao tuổi thì lại có nguy cơ tăng.
- Các loại E. coli khác có thể gây ra nhiễm khuẩn thận, bàng quang và các bộ phận khác trong cơ thể.
1.4.1.2. Bacillus cereus
Bacillus cereus là loài vi khuẩn gram dương, hình que, hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả năng sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955. Từ những năm1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều.
Theo phân loại khoa học:
- Ngành (Division):Firmicutes
- Lớp (Class):Bacilli
- Bộ (Order):Bacillales
- Họ (Family):Bacillaceae
- Giống (Genus):Bacillus
- Loài (Species):Bacillus cereus
Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử. Kích thước 0.5 – 1.5 x 2 – 4 mm. Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động
Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm.
Đặc điểm nuôi cấy:
Là loại vi khuẩn dễ mọc, hiếu khí và kị khí tùy nghi, sống ở nhiệt độ thích hợp 5 – 50oC, tối ưu 35 – 40oC, độ ph 4.5 – 9.3; thích hợp 7 – 7.2.
- Trên môi trường NA hay TSB sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì. - Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng.
- Trên môi trường MYP: khóm hồng chung quanh có vòng sáng.
- Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng sáng.
- Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn.
Hình 1. 22: Vi khuẩnBacillus cereustrên kính hiển vi
Độc tố:vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố
- Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt , rau quả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng.
- Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không
bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.
Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn.
1.4.1.3. Salmonella
Năm 1855 Slamon và Smith tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả và gọi tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella. Nhưng sau đó Schweinittz
xác địnhSalmonella cholerasuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn.
Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người bệnh, ông gọi vi khuẩn này là Bacilus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi là
Salmonella enteritidis.
Phân loại khoa học:
- Giới (Kingdom): Bacteria
- Ngành (Division): Proteobacteria
- Lớp (Class): Gammaproteobacteria
- Bộ (Order): Enterobacteriales
- Họ (Family): Enterobacteriaceae
- Giống (Genus):Salmonella lignieres 1900
Salmonella là một giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi, không tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường kính khoảng 0.7 µm đến 1.5 µm, dài từ 2 µm đến 5 µm và có vành lông rung hình roi. Phát triển tốt ở 6℃ – 42 ℃, thích hợp nhất là 35 ℃– 37 ℃, pH từ 6 - 9, thích hợp nhất là 7.2 . ở nhiệt độ 18℃– 40℃vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày.
Trên môi trường phân lập XLD khuẩn lạc có hình tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, môi trường chuyển sang màu vàng.
Độc tố: vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố:
- Nội độc tố: rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét; độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật.
- Ngoại độc tố: chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, đem cấy truyền 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có thể gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kị khí. Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột.
1.4.1.4. Staphylococcus aureus
Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng.
Staphylococcus aureusdo Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878, phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học.
Phân loại khoa học:
- Giới (Kingdom):Eubacteria
- Ngành (Division):Firmicutes
- Lớp (Class):Bacilli
- Bộ (Order):Bacillales
- Họ (Family):Staphylococcaceae
- Giống (Genus):Staphylococcus
- Loài (Species):Staphylococcus aureus
Hình 1. 24: Vi khuẩnStaphylococus aureustrên kính hiển vi
Staphylococcus có nguồn từ tiếng Hy Lạp staphyle nghĩa là chùm nho là các cầu khuẩn kị khí tuỳ ý. Vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào
và thường không có vỏ,có hình cầu, đường kính 0.8 - 1 µm, hình thức tập hợp này do vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian; trong bệnh phẩm vi khuẩn có thể đứng lẻ, từng đôi hoặc đám nhỏ.
Một số Staphylococcus được tìm thấy khắp nơi và có thể phân lập từ không khí, bụi, thực phẩm, thường trú ở vùng da và niêm mạc của người.
Phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp. Theo Mc Landsborough L. (2005), nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của S. aureuslà 18 – 40 ℃, pH = 7,2. Tuy nhiên mọc tốt nhất ở 25℃, hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý. Ở canh thang, sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ. Ở môi trường đặc, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh co thể có màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ngoài ra S.aureus có thể sinh trưởng được trên môi trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn khác hoặc môi trường có nồng độ muối cao.
Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 15 ℃, nhiều nhất là khi tăng trưởng ở 35 – 37℃.
Staphylococcus aureus có trong nhiều môi trường sống trước đây, thường sống ký sinh vô hại, nhưng cũng có thể gây bệnh, đặc biệt là khi Staphylococcus aureus xâm nhập hoặc xuyên qua da, chúng có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng khác nhau, chẳng hạn như các sự nhiễm trùng da, làm loét, phỏng da hoặc các sự nhiễm trùng nặng trong máu, phổi hoặc các mô khác.
Độc tố - Enzym:
- Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng là do vi khuẩn phát triển nhanh và lan tràn rộng rãi trong mô cũng như tạo thành nhiều độc tố và enzyme. Một số chủng thuộc loài S. aureus có khả năng sinh tổng hợp enterotoxin khi chúng nhiễm vào thực phẩm
- Độc tố: Hầu hết các dòng S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 15℃hơn cả vi khuẩn.
- Độc tố ruột enterotoxin sản xuất bởiS.aureuslà một protein ổn định nhiệt,nhiều nhất khi tăng trưởng ở nhiệt độ 35 – 37℃vàcóthể tồn tại nhiệt ở 100 ℃trong vòng 30–700 phút.
• Protease phân giải protein của tế bào chủ. • Lipase phân giải lipid.
• Deoxyribonuclease (DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo (FAME).
1.4.1.5. Pseudomonas aeruginosa
Theo phân loại của Bergey D.G.(1984), Pseudomonas aeruginosa thuộc giống Pseudomonas, họ Pseudomonadaceae. Căn cứ vào sự tương đồng rARN/ADN và những đặc điểm nuôi cấy thông thường, người ta chia giống Pseudomonas thành 92 loài khác nhau, trong đó Pseudomonas aeruginosa là một trong số 12 loài có liên quan nhiều đến y học. Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) là trực khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng riêng lẻ, thành đôi và có khi xếp thành chuỗi. Di động nhờ một lông duy nhất ở một cực. Có pili, không bào tử.
Phân loại khoa học:
- Giới (Kingdom): Bacteria
- Ngành (Division): Proteobacteria
- Lớp (Class): Gamma proteobacteria
- Bộ (Order): Pseudomonadales
- Họ (Family): Pseudomonas
- Giống (Genus): Pseudomonas aeruginosa
Hình 1. 25: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi
Sức đề kháng:
- Có sức đề kháng cao với các yếu tố lý hoá. - Có khả năng đề kháng kháng sinh cao.
Kháng nguyên:
- Kháng nguyên liên kết với tế bào:
+ Polysaccharide ngoại tiết: có 2 loại polysaccharide được tạo ra bởi những chủngP. aeruginosacó khuẩn lạc dạng M và dạng R.
- Các kháng nguyên ngoại bào: vi khuẩn tiết ra rất nhiều chất chuyển hoá trong môi trường (protease, elastase, exotoxin A, glycocalx, hemolysine, ...) là những yếu tố độc lực của vi khuẩn đồng thời còn là những kháng nguyên được nghiên cứu để sử dụng chế tạo vaccine gây miễn dịch.
Phân loại trực khuẩn mủ xanh:
Việc xác định type rất có ý nghĩa trong phân loại, xác định tính phổ biến và sự phân bố của vi khuẩn theo địa dư và các loại bệnh, để từ đó có cơ sở nghiên cứu chế tạo ra các chế phẩm miễn dịch phòng và điều trị các nhiễm khuẩn do P. aeruginosa. Mặt khác, các phương pháp xác định type cũng có tầm quan trọng trong điều tra dịch tễ học quá trình lây nhiễm loài vi khuẩn này. Những phương pháp hay sử dụng nhất là serotype, lysotype và pyocinotype; các phương pháp này cho phép xác định type của 90 – 95 % số chủng P. aeruginosa. Theo Uỷ ban phân loại Quốc tế, việc định type kháng nguyên O chiaP. aeruginosathành 16 nhóm kháng nguyên được ký hiệu
từ O1đến O16(hoặc P1đến P16).
Nội độc tố:
Là thành phần của vách tế bào vi khuẩn. Nội độc tố bao gồm chủ yếu là LPS và một lượng nhỏ protein. Hoạt tính sinh học của nội độc tố chủ yếu do phức hợp LPS đảm nhiệm. LPS có vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn huyết.
Ngoại độc tố:
Bản chất là protein có trọng lượng phân tử 66,6 kDa. Exotoxin A hoạt động tượng tự như cơ chế hoạt động của độc tố vi khuẩn bạch hầu. Với khả năng khuếch tán và ức chế sự tổng hợp protein của tế bào, exotoxin A là một độc tố mạnh nhất của
P. aeruginosa. Exotoxin A gây rối loạn chức năng huyết động trung tâm, thay đổi chức năng đông máu, rối loạn chuyển hoá lipit, gây tổn thương nhiều cơ quan, nhưng biểu hiện rõ rệt nhất là tổn thương gan. 90% số chủngP. aeruginosasản xuất exotoxin A nhưng đặc tính của độc tố này rất khác nhau tuỳ từng chủng.
1.4.2. Phương pháp khuếch tán đĩa