Các dụng cụ thiết bị cần thiết cho ghiên cứu:
Cân phân tích
Máy cô quay chân không
Máy lọc hút chân không
Nhiệt kế 200oC
Máy khuấy từ gia nhiệt + cá từ
Thiết bị chiết Soxhlet
Ống nghiệm Bình cầu 2 cổ Bình cầu 1 cổ Phễu chiết 500 ml Beacher 250 ml Beacher 100 ml Erlen 250 ml Erlen 100 ml 2.1.4. Môi trường
Bảng 2. 1: Môi trường Trypticase Soy Broth
Hoá chất Liều lượng
Tryptone 15 g
Peptone from soy bean 5 g
NaCl 5 g
Nước cất đủ 1000 ml
Đun nóng, phân phối môi trường vào các ống nghiệm, hấp khử trùng 15 phút ở 121℃.
Môi trường đặc MHA dùng để đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng phường pháp khuếch tán qua thạch:
Bảng 2. 2: Môi trường Mueller Hinton Agar
Hoá chất Liều lượng
Mueller Hinton Agar 38 g
Agar 10 g
Nước cất đủ 1000 ml
Đun để hoà tan các thành phần trong nước cất. Điều chỉnh Ph = 7.4, hấp khử trùng 15 phút ở 121℃. Rót ra đĩa petri.
2.2. Thực nghiệm
2.2.1. Chiết cao vỏ lá Lô hội bằng phương pháp Soxhlet
Theo nguyên tắc, làm việc trên 1 yếu tố thí nghiệm còn cố định các yếu tố còn lại, kết quả tốt nhất của thí nghiệm trước được rút ra làm thông số cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Chỉ tiêu đánh giá là khối lượng cao được chiết với các dung môi khác nhau.
Thí nghiệm xác định dung môi chiết:
Dung môi là yếu tố quan trọng nhất trong việc trích ly. Việc lựa chọn dung môi có thể ảnh hưởng khối lượng cao được chiết.
Hình 2. 1: Sơ đồ khảo sát chiết cao vỏ lá Lô hội bằng phương pháp Soxhlet
Thuyết mình quy trình:
- Bước 1: Cân 10 g vỏ lá Lô hội. Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm).
- Bước 2: Thêm 250 ml dung môi (Ethyl, Ether, Methanol, Ethanol, Hexan) cho vào bình cầu 2 cổ và lắp hệ thống soxhlet. Đun nguyên liệu trong 6 giờ.
- Bước 3: Thu được dịch chiết đem cô quay thu hồi dung môi.Bảo quản cao chiết trong lọ dung tích khoảng 5 – 10 ml, đậy kín, bảo quản trong tủ lạnh.
- Bước 4: Cân khối lượng cao chiết của 6 dung môi và nhận thấy dung môi Ethanol có lượng cao nhiều sau Methanol (do Methanol có tính độc nên chọn dung môi trích ly chiết cao là Ethanol).
Mô tả quá trình thực nghiệm chiết cao Lô hội tại phòng thí nghiệm:
Thời gian trích ly: 6h,7h,8h,9h, 10h Tỉ lệ DM:NL là 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1 Ethyl Acetate Ether Methanol Ethanol Hexan
Hình 2. 2: Hệ thống chiết cao tại phòng thí nghiệm
Mục đích: Khảo sát nhằm thu hiệu suất cao vỏ lá Lô hội qua các hệ dung môi và định tính các thành phần có trong dịch chiết lá Lô hội.
Kế hoạch: Chiết vỏ lá Lô hội bằng nhiều hệ dung môi có độ phân cực khác nhau (Ethyl, Ether, Methanol, Ethanol, Hexan) và tối ưu quy trình theo phương pháp soxhlet.
Thực nghiệm: Cân 10g vỏ lá Lô hội cho vào túi lọc và đặt vào bình chiết, thêm dung môi vào bình cầu sao cho dung môi trong bình cầu không được nhiều hơn hai phần ba thể tích bình cầu. Lắp hệ thống Soxhlet và kiểm tra hệ thống, mở nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng, cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt cho dung môi trong bình cầu sôi đều. Chiết trong thời gian 6h. Tháo hệ thống soxhlet, tiến hành lọc dịch chiết bằng máy lọc hút chân không, sau đó đưa đi cô quay thu hồi dung môi.
Thí nghiệm xác định nồng độ dung môi Ethanol:
Nồng độ Ethanol ảnh hưởng đến sự phân tán và thấm thấu vào nguyên liệu để hoà tan các hợp chất hữu cơ cần thiết.
- Khảo sát các nồng độ Ethanol: 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 96%.
Thí nghiệm xác định tỉ lệ dung môi/nguyên liệu:
Nếu tỉ lệ dung môi/nguyên liệu không phù hợp thì lượng cao vỏ lá Lô hội thu được chưa hoàn toàn chiết kiệt hoặc gây tổn hao năng lượng vì dung môi quá nhiều.
- Cố định thông số thời gian (đã khảo sát ở 2.2.1.2);
- Khảo sát các thông số tỉ lệ dung môi/nguyên liệu gồm 15:1; 20:1; 25:1; 30:1; 35:1.
Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết:
Thời gian chiết có vai trò quyết định lượng cao vỏ lá Lô hội sau khi chiết. Nếu thời gian quá ngắn thì lượng cao Lô hội được chưa hoàn toàn, ngược lại khi chiết quá lâu vừa tốn thời gian, tổn hao năng lượng và các chất trong cao bị oxy hoá biến tính.
- Dung môi chiết: Ethanol;
- Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 25:1;
- Khảo sát các thông số thời gian 5h, 6h, 7h, 8h, 9h, 10h.
2.2.2. Định tính một số hợp chất tự nhiên trong dịch chiết vỏ lá Lô hộiKhảo sát sự hiện diện của các hợp chất Anthranoid Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Anthranoid
Phản ứng Borntraeger Thực nghiệm:
Cho erlen chứa các dung dịch sau: - Dịch ethanol 1 ml
- HCl 4N 4 ml
- FeCl320% 4 ml
- Bột khô vỏ lá Lô hội 1 g
Đun cách thuỷ trong 10 phút, để nguội và cho vào bình gạn dung tích 50 ml. Lắc với 5 ml ether. Gạn bỏ nước. Lớp ether được giữ lại để thực hiện phản ứng.
Lấy 1 ml dịch chiết ether cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm từ từ từng giọt đến hết 1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nh .
Dung dịch lớp kiềm có màu đỏ sim.
Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid
- Thuốc thử Liebermann – Burchard:
Anhidrid acetic 1 ml
H2SO4đậm đặc
Dung dịch màu xanh lục.
- Thuốc thử Salkowski: H2SO4đậm đặc.
Thực nghiệm:Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ đến hết 1 ml dung dịch H2SO4đậm đặc vào ống nghiệm.
Dung dịch màu xanh tím.
Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid
- Thuốc thử Wagner:
I2 1.27 g
KI 2 g
H2O vừa đủ 100 ml
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, nghiên ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên.
Có xuất hiện tủa màu nâu.
Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid
Một số thuốc thử Flavnoid:
o Với dung dịch FeCl3bão hòa:
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch chiết, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.
Dung dịch màu xanh đen.
o Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến xanh dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau.
Thực nghiệm:Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến 1 ml H2SO4 đậm đặc, đun nóng trong 1 phút.
Dung dịch màu vàng cam.
Khảo sát sự hiện diện của saponin
Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base:
- Thuốc thử: HCl 0.1 N
- Ống 2: 5 ml NaOH 0.1 N (pH = 13) và 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử. - Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả hai ống nghiệm trong 1 phút và để yên,
quan sát chiều cao cột bọt trong cả hai ống nghiệm.
- Nếu cột bọt trong cả hai ống nghiệm cao bằng nhau và cột bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpenoid.
- Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin steroid.
2.2.3. Định danh một số hợp chất tự nhiên trong cao Lô hội
Thành phẩm cao Lô hội (dịch chiết đã được tiến hành thu hồi dung môi cho tới khi mẫu ở dạng cao). Gửi mẫu đến VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM, VIỆN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC (01 – Mạc Đĩnh Chi – Quận 1 – Tp. Hồ Chí Minh).
2.2.4. Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của cao Lô hội
- Môi trường: Môi trường tăng sinh và tồn trữ TSB, môi trường hoạt tính kháng khuẩn MHA.
- Độ đục chuẩn 0.5 MC Farland: tương ứng với 108 vi khuẩn/ml, sử dụng làm độc đục chuẩn khi pha loãng dịch vi khuẩn. Cách pha: 0.5 ml BaCl2 0.048M + 99.5 ml H2SO40.19M.
- Chuẩn bị dịch kháng khuẩn:
Cao Lô hội được pha trong dung dịch DMSO 5 % vô trùng với:
1600 mag/ml: 1.6 g Cao + 1 ml DMSO 5%;
800 mg/ml: 1 ml dịch nồng độ 1600 mg/ml + 1 ml DMSO 5%;
400 mg/ml: 1 dịch ml nồng độ 800 mg/ml + 1 ml DMSO 5%;
200 mg/ml: 1 dịch ml nồng độ 400 mg/ml + 1 ml DMSO 5%.
Các kháng sinh được sử dụng để đối chứng dương là Chloramphenicol và Tetracycline (1 mg/ml pha trong DMSO 5%), chứng âm là dung dịch DMSO 5% vô trùng.
- Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm:
Vi khuẩn sau khi lấy về sẽ được cấy ria trên môi trường thạch dinh dưỡng MHA, đem ủ ở 37oC trong vòng 16 đến 24 giờ để chọn ra các khuẩn lạc đặc trưng. Khi chọn được khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch không bị nhiễm thì đem tăng sinh
chúng trong môi trường lỏng TSB rồi ủ ở 37 oC, lắc với tốc độ 100 rpm trong 10 – 12 giờ. Môi trường trở nên đục do có sự tăng sinh của vi sinh vật.
Huyền phù vi khuẩn sau đó được ly tâm trong 15 phút ở 5000 rpm để tách sinh khối ra khỏi môi trường rồi rửa sinh khối vi sinh vật bằng 3 lần nước cất vô trùng và pha loãng bằng nước cất vô trùng đến độ đục tương đương 0.5 MC Farland. Huyền phù vi khuẩn này được dùng để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn.
Thực nghiệm:
Dùng micropipet hút 100µl vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 108 CFU/ml), sau đó tiến hành cấy chang trên bề mặt đĩa thạch MHA, chờ khô bề mặt. Đánh số cho đĩa petri từ 1 đến 7. Đĩa giấy 6 mm đã được vô trùng được thấm vào dịch cao đã được pha theo từng nồng độ lần lượt là 1600, 800, 400, 200 mg/ml và lấy ra đặt lên mặt đĩa thạch đã cấy chang vi khuẩn (số 1: 1600 mg/ml; số 2: 800 mg/ml; số 3: 400 mg/ml; số 4: 200 mg/ml), đè nh để đĩa giấy cố định trên mặt thạch. Hai đối chứng dương là kháng sinh Tetrcyline và Chloramphenicol được thấm vào đĩa giấy và đặt lên đĩa thạch (số 5: Tetracyline; số 6: Chloramphenicol). Đĩa giấy ở giữa thấm dung dịch đối chứng âm DMSO 5% (số 7).
Sau đó đem nuôi ở 37 oC trong 16 – 18 giờ, riêng Staphylococcus aureus
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả chiết tách cao vỏ lá Lô hội
Qua quá trình thực nghiệm quy trình chiết cao vỏ lá Lô hội bằng Soxhlet:
Kết quả thí nghiệm xác định dung môi chiết:
Bảng 3. 1: Khối lượng cao vỏ lá Lô hội thu được từ 5 dung môi chiết
Dung môi Thời gian
Etyl
Acetat Ether Methanol Ethanol
96o Hexan
6h 0.73 g 0.56 g 2.53 g 2.37 g 0.47 g
Hình 3. 1: Biểu đồ ảnh hưởng của các dung môi đến hiệu suất cao chiết cao vỏ lá Lô Hội
Nhận xét:Khả năng hòa tan của các chất có hoạt tính sinh học trong lá Lô hội khác nhau tùy thuộc vào loại dung môi. Ở các thời gian khác nhau, thì dịch chiết thu được có thành phần các hợp chất hòa tan khác nhau.
Khi chiết vỏ lá Lô hội với 5 dung môi khác nhau bằng hệ thống Soxhlet ở thời gian 6h với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 25:1 thì lượng cao vỏ lá Lô hội thu được cao nhất là chiết với dung môi Methanol có khối lượng cao là 2.53 g (H = 25.3%). Dung môi có lượng cao vỏ lá Lô hội cũng không kém Methanol là Ethanol 96% có lượng cao là 2.37g (H = 23.7%). Lượng cao vỏ lá Lô hội thu được thấp nhất
khi chiết với Hexan có khối lượng cao là 0.47 g (H = 4.7 %). Hai dung môi còn lại là Ethyl Acetat (H = 7.3%) có hiệu suất cao hơn dung môi Hexan (H = 5.6%)
Kết quả thí nghiệm xác định nồng độ dung môi Ethanol
Bảng 3. 2: Khối lượng cao chiết vỏ lá Lô Hội với dung môi Ethanol ở các nồng độ khác nhau
Dung môi
Ethanol 60% 65% 70% 75% 80% 85% 90% 96%
Khối lượng
cao (g) 2.15 3.11 3.98 3.86 2.71 2.67 2.69 2.37
Hình 3. 2: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ Ethanol đến hiệu suất cao chiết vỏ lá Lô Hội
Nhận xét: Khi chiết vỏ lá Lô hội với dung môi Ethanol ở các nồng độ khác nhau bằng hệ thống Soxhlet ở thời gian 6h, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 25:1 thì lượng cao Lô hội thu được cao nhất ở nồng độ 70% có khối lượng là 3.98 g (H = 39.8%) và lượng cao Lô hội giảm dần khi nồng độ Ethanol tăng, lượng cao thấp nhất là ở nồng độ 60% với khối lượng cao là 2.15 g (H = 21.5%). Do vậy ở nồng độ Ethanol 70% có khối lượng và hiệu suất cao nhất tối ưu nhất.
Bảng 3. 3: Khối lượng cao chiết vỏ lá Lô Hội với Ethanol 70% ở các tỉ lệ khác nhau
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 15:1 20:1 25:1 30:1 35:1
Khối lượng cao (g) 2.98 3.03 3.61 3.49 3.46
Hình 3. 3: Biểu đồ ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hiệu suất cao chiết vỏ lá Lô Hội
Nhận xét: Nhận thấy khi thay đổi tỉ lệ dung môi/nguyên liệu thì khối lượng cũng tăng nhưng tăng không đáng kể. Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đạt hiệu suất cao chiết cao nhất là 25:1.
Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết
Bảng 3. 4: Khối lượng cao chiết vỏ lá Lô Hội với dung môi Ethanol 70% ở các khoảng thời gian khác nhau
Thời gian (h) 5 6 7 8 9 10
Khối lượng cao
Hình 3. 4: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất cao chiết vỏ lá Lô Hội
Nhận xét: Khi tăng thời gian chiết thì khối lượng cao chiết có xu hướng giảm dẫn đến hiệu suất chiết cũng giảm. Tuy nhiên, chiết ở khoảng thời gian 7h thì hiệu suất chiết đạt cao nhất là 37.3% tương đương với 3.73 g cao chiết. Như vậy lựa chọn thời gian chiết 7h cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.1. Kết quả định tính một số hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết cao Lô hội
Định tính thành phần dược liệu được thể hiện ở các bảng. Dấu (-) cho kết quả âm tính.
Dấu (+) cho kết quả dương tính với thuốc thử, có mặt nhóm chất tương ứng cần định tính.
Bảng 3. 5: Kết quả định tính thành phần dược liệu trong cao Ethyl Acetate
Nhóm chất Phản ứng
thuốc thử Màu sắc Kết quả Kết luận
Anthranoid Phản ứng Borntraeger + Có chứa Anthranoid Steroid - triterpenoid Liebermann – Burchard + Có chứa Steroid - triterpenoid Salkowski + Alkaloid TT Wagner - Không chứa Alkaloid Flavonoid FeCl3 bão hòa + Có chứa Flavonoid H2SO4 đậm đặc + Saponin TT HCl 0.1N TT NaOH 0.1N - Không chứa Saponin
Bảng 3. 6: Kết quả định tính thành phần dược liệu trong cao Ether
Nhóm chất Phản ứng
thuốc thử Màu sắc Kết quả Kết luận
Anthranoid Phản ứng Borntraeger + Có chứa Anthranoid Steroid - triterpenoid Liebermann – Burchard + Có chứa Steroid - triterpenoid Salkowski + Alkaloid TT Wagner - Không chứa Alkaloid Flavonoid FeCl3 bão hòa - Không chứa Flavonoid H2SO4 đậm đặc - Saponin TT HCl 0.1N TT NaOH 0.1N - Không chứa Saponin
Bảng 3. 7: Kết quả định tính thành phần dược liệu trong cao Methanol
Nhóm chất Phản ứng
thuốc thử Màu sắc Kết quả Kết luận
Anthranoid Phản ứng Borntraeger + Có chứa Anthranoid Steroid - triterpenoid Liebermann – Burchard + Có chứa Steroid - triterpenoid Salkowski +
Alkraloid TT Wagner + Có chứa
Alkaloid Flavonoid FeCl3 bão hòa - Không chứa Flavonoid H2SO4 đậm đặc - Saponin TT HCl 0.1N TT NaOH 0.1N - Không chứa Saponin
Bảng 3. 8: Kết quả định tính thành phần dược liệu trong cao Ethanol
Nhóm chất Phản ứng
thuốc thử Màu sắc Kết quả Kết luận
Anthranoid Phản ứng Borntraeger + Có chứa Anthranoid Steroid - triterpenoid Lie bermann –