Hệ thống sắc ký khí khối phổ là một detector khối phổ được ghép nối với thiết bị sắc ký khí nối với nhau qua bộ kết nối với mục đích loại bỏ khí mang N2, He để giảm áp suất của dòng áp suất của dòng khí mang và phân tử mẫu chất đi vào buồng ion hóa của khối phổ. Phần thiết bị sắc ký dùng mao quản, phần khối phổ sử dùng buồng ion hóa với bộ tách từ cực và detector khối phổ.
GC – MS bao gồm:
Sắc ký khí ( GC): sắc ký khí là phương pháp phân tách, phân ly, phân tích, các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh.
Khối phổ (MS): khối phổ là phương pháp phân tích mà trong đó hợp chất xét nghiệm được ion hóa và phá thành các mảnh trong thể khí dưới chân không cao (10 – 6 mmHg). Sau quá trình ion hóa, các hạt có điện tích đó được gia tốc trong một điện trường, được tách trong một từ trường theo tương quan giữa khối lượng và điện tích của chúng và ghi nhận theo cường độ của các hạt đó. Dùng để xác định định định tính và định lượng.
Hình 1. 27: Sơ đồ sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS)
Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động:
- Cửa tiêm mẫu (injection port): 1 microliter dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm vào hệ thống ở cửa này. Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là helium. Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 300c để mẫu trở thành dạng khí.
- Vỏ ngoài (oven): phần vỏ của hệ thống GC chính là lò nung đặc biệt. nhiệt độ của lò này dao động từ 40 – 320oC.
- Cột (cloumn):
Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30m với mặt trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt. Các chất trong hỗn hợp được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này.
Sau đó đi qua cột sắc ký khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ. ở đây chúng bị ion hóa. Sau khi khối phổ, chúng sẽ tới bộ phận lọc dựa trên khối lượng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua. Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối lượng. Thông tin này sau đó được chuyển đến máy tính và xuất ra kết qua gọi là khối phổ. Khối phổ là một biểu đồ phản ánh số lượng các ion với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc.
- Máy tính: bộ phận chịu trách nhiệm tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp và đưa ra kết quả khối phổ.
Ứng dụng của phương pháp sắc ký khí khối phổ:
- Xác định công thức phân tử, dựa vào cường độ tương đối của ion phân tử đồng vị xuất hiện trong phổ đồ.
- Xác định công thức cấu tạo: dựa vào giá trị m/e, cường độ tương đối của các ion phân tử cũng như ion mảng.
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Hoá Dầu, Phòng nghiên cứu khoa học của ngành Công Nghệ Kỹ Thuật Hoá Học và phòng thí nghiệm vi sinh của ngành Công Nghệ Thực Phẩm tại Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu.
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất
Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu là cây Lô hội được lấy từ xã Long Phước, Bà Rịa. Nguyên liệu sau khi hái được đem rửa sạch và loại chất nhựa salext màu vàng. Phần lá được đem sấy khô ở nhiệt độ 80oC sau đó nghiền nhỏ. Hóa chất được sử dụng cho chiết tách và định tính thành phần hóa học trong Lô hội:
Ethanol 96o, Trung Quốc
Ethyl ether, Trung Quốc
Methanol, Trung Quốc
Hexan, Trung Quốc
N – Butanol, Trung Quốc
HCl, Trung Quốc
FeCl3, Trung Quốc
NaOH, Trung Quốc
H2SO4, Trung Quốc
HgCl2, Trung Quốc
I2, Trung Quốc
KI, Trung Quốc
2.1.3. Dụng cụ thí nghiệm
Các dụng cụ thiết bị cần thiết cho ghiên cứu:
Cân phân tích
Máy cô quay chân không
Máy lọc hút chân không
Nhiệt kế 200oC
Máy khuấy từ gia nhiệt + cá từ
Thiết bị chiết Soxhlet
Ống nghiệm Bình cầu 2 cổ Bình cầu 1 cổ Phễu chiết 500 ml Beacher 250 ml Beacher 100 ml Erlen 250 ml Erlen 100 ml 2.1.4. Môi trường
Bảng 2. 1: Môi trường Trypticase Soy Broth
Hoá chất Liều lượng
Tryptone 15 g
Peptone from soy bean 5 g
NaCl 5 g
Nước cất đủ 1000 ml
Đun nóng, phân phối môi trường vào các ống nghiệm, hấp khử trùng 15 phút ở 121℃.
Môi trường đặc MHA dùng để đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng phường pháp khuếch tán qua thạch:
Bảng 2. 2: Môi trường Mueller Hinton Agar
Hoá chất Liều lượng
Mueller Hinton Agar 38 g
Agar 10 g
Nước cất đủ 1000 ml
Đun để hoà tan các thành phần trong nước cất. Điều chỉnh Ph = 7.4, hấp khử trùng 15 phút ở 121℃. Rót ra đĩa petri.
2.2. Thực nghiệm
2.2.1. Chiết cao vỏ lá Lô hội bằng phương pháp Soxhlet
Theo nguyên tắc, làm việc trên 1 yếu tố thí nghiệm còn cố định các yếu tố còn lại, kết quả tốt nhất của thí nghiệm trước được rút ra làm thông số cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Chỉ tiêu đánh giá là khối lượng cao được chiết với các dung môi khác nhau.
Thí nghiệm xác định dung môi chiết:
Dung môi là yếu tố quan trọng nhất trong việc trích ly. Việc lựa chọn dung môi có thể ảnh hưởng khối lượng cao được chiết.
Hình 2. 1: Sơ đồ khảo sát chiết cao vỏ lá Lô hội bằng phương pháp Soxhlet
Thuyết mình quy trình:
- Bước 1: Cân 10 g vỏ lá Lô hội. Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm).
- Bước 2: Thêm 250 ml dung môi (Ethyl, Ether, Methanol, Ethanol, Hexan) cho vào bình cầu 2 cổ và lắp hệ thống soxhlet. Đun nguyên liệu trong 6 giờ.
- Bước 3: Thu được dịch chiết đem cô quay thu hồi dung môi.Bảo quản cao chiết trong lọ dung tích khoảng 5 – 10 ml, đậy kín, bảo quản trong tủ lạnh.
- Bước 4: Cân khối lượng cao chiết của 6 dung môi và nhận thấy dung môi Ethanol có lượng cao nhiều sau Methanol (do Methanol có tính độc nên chọn dung môi trích ly chiết cao là Ethanol).
Mô tả quá trình thực nghiệm chiết cao Lô hội tại phòng thí nghiệm:
Thời gian trích ly: 6h,7h,8h,9h, 10h Tỉ lệ DM:NL là 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1 Ethyl Acetate Ether Methanol Ethanol Hexan
Hình 2. 2: Hệ thống chiết cao tại phòng thí nghiệm
Mục đích: Khảo sát nhằm thu hiệu suất cao vỏ lá Lô hội qua các hệ dung môi và định tính các thành phần có trong dịch chiết lá Lô hội.
Kế hoạch: Chiết vỏ lá Lô hội bằng nhiều hệ dung môi có độ phân cực khác nhau (Ethyl, Ether, Methanol, Ethanol, Hexan) và tối ưu quy trình theo phương pháp soxhlet.
Thực nghiệm: Cân 10g vỏ lá Lô hội cho vào túi lọc và đặt vào bình chiết, thêm dung môi vào bình cầu sao cho dung môi trong bình cầu không được nhiều hơn hai phần ba thể tích bình cầu. Lắp hệ thống Soxhlet và kiểm tra hệ thống, mở nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng, cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt cho dung môi trong bình cầu sôi đều. Chiết trong thời gian 6h. Tháo hệ thống soxhlet, tiến hành lọc dịch chiết bằng máy lọc hút chân không, sau đó đưa đi cô quay thu hồi dung môi.
Thí nghiệm xác định nồng độ dung môi Ethanol:
Nồng độ Ethanol ảnh hưởng đến sự phân tán và thấm thấu vào nguyên liệu để hoà tan các hợp chất hữu cơ cần thiết.
- Khảo sát các nồng độ Ethanol: 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 96%.
Thí nghiệm xác định tỉ lệ dung môi/nguyên liệu:
Nếu tỉ lệ dung môi/nguyên liệu không phù hợp thì lượng cao vỏ lá Lô hội thu được chưa hoàn toàn chiết kiệt hoặc gây tổn hao năng lượng vì dung môi quá nhiều.
- Cố định thông số thời gian (đã khảo sát ở 2.2.1.2);
- Khảo sát các thông số tỉ lệ dung môi/nguyên liệu gồm 15:1; 20:1; 25:1; 30:1; 35:1.
Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết:
Thời gian chiết có vai trò quyết định lượng cao vỏ lá Lô hội sau khi chiết. Nếu thời gian quá ngắn thì lượng cao Lô hội được chưa hoàn toàn, ngược lại khi chiết quá lâu vừa tốn thời gian, tổn hao năng lượng và các chất trong cao bị oxy hoá biến tính.
- Dung môi chiết: Ethanol;
- Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 25:1;
- Khảo sát các thông số thời gian 5h, 6h, 7h, 8h, 9h, 10h.
2.2.2. Định tính một số hợp chất tự nhiên trong dịch chiết vỏ lá Lô hộiKhảo sát sự hiện diện của các hợp chất Anthranoid Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Anthranoid
Phản ứng Borntraeger Thực nghiệm:
Cho erlen chứa các dung dịch sau: - Dịch ethanol 1 ml
- HCl 4N 4 ml
- FeCl320% 4 ml
- Bột khô vỏ lá Lô hội 1 g
Đun cách thuỷ trong 10 phút, để nguội và cho vào bình gạn dung tích 50 ml. Lắc với 5 ml ether. Gạn bỏ nước. Lớp ether được giữ lại để thực hiện phản ứng.
Lấy 1 ml dịch chiết ether cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm từ từ từng giọt đến hết 1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nh .
Dung dịch lớp kiềm có màu đỏ sim.
Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid
- Thuốc thử Liebermann – Burchard:
Anhidrid acetic 1 ml
H2SO4đậm đặc
Dung dịch màu xanh lục.
- Thuốc thử Salkowski: H2SO4đậm đặc.
Thực nghiệm:Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ đến hết 1 ml dung dịch H2SO4đậm đặc vào ống nghiệm.
Dung dịch màu xanh tím.
Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid
- Thuốc thử Wagner:
I2 1.27 g
KI 2 g
H2O vừa đủ 100 ml
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, nghiên ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên.
Có xuất hiện tủa màu nâu.
Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid
Một số thuốc thử Flavnoid:
o Với dung dịch FeCl3bão hòa:
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch chiết, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.
Dung dịch màu xanh đen.
o Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến xanh dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau.
Thực nghiệm:Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến 1 ml H2SO4 đậm đặc, đun nóng trong 1 phút.
Dung dịch màu vàng cam.
Khảo sát sự hiện diện của saponin
Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base:
- Thuốc thử: HCl 0.1 N
- Ống 2: 5 ml NaOH 0.1 N (pH = 13) và 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử. - Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả hai ống nghiệm trong 1 phút và để yên,
quan sát chiều cao cột bọt trong cả hai ống nghiệm.
- Nếu cột bọt trong cả hai ống nghiệm cao bằng nhau và cột bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpenoid.
- Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin steroid.
2.2.3. Định danh một số hợp chất tự nhiên trong cao Lô hội
Thành phẩm cao Lô hội (dịch chiết đã được tiến hành thu hồi dung môi cho tới khi mẫu ở dạng cao). Gửi mẫu đến VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM, VIỆN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC (01 – Mạc Đĩnh Chi – Quận 1 – Tp. Hồ Chí Minh).
2.2.4. Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của cao Lô hội
- Môi trường: Môi trường tăng sinh và tồn trữ TSB, môi trường hoạt tính kháng khuẩn MHA.
- Độ đục chuẩn 0.5 MC Farland: tương ứng với 108 vi khuẩn/ml, sử dụng làm độc đục chuẩn khi pha loãng dịch vi khuẩn. Cách pha: 0.5 ml BaCl2 0.048M + 99.5 ml H2SO40.19M.
- Chuẩn bị dịch kháng khuẩn:
Cao Lô hội được pha trong dung dịch DMSO 5 % vô trùng với:
1600 mag/ml: 1.6 g Cao + 1 ml DMSO 5%;
800 mg/ml: 1 ml dịch nồng độ 1600 mg/ml + 1 ml DMSO 5%;
400 mg/ml: 1 dịch ml nồng độ 800 mg/ml + 1 ml DMSO 5%;
200 mg/ml: 1 dịch ml nồng độ 400 mg/ml + 1 ml DMSO 5%.
Các kháng sinh được sử dụng để đối chứng dương là Chloramphenicol và Tetracycline (1 mg/ml pha trong DMSO 5%), chứng âm là dung dịch DMSO 5% vô trùng.
- Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm:
Vi khuẩn sau khi lấy về sẽ được cấy ria trên môi trường thạch dinh dưỡng MHA, đem ủ ở 37oC trong vòng 16 đến 24 giờ để chọn ra các khuẩn lạc đặc trưng. Khi chọn được khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch không bị nhiễm thì đem tăng sinh
chúng trong môi trường lỏng TSB rồi ủ ở 37 oC, lắc với tốc độ 100 rpm trong 10 – 12 giờ. Môi trường trở nên đục do có sự tăng sinh của vi sinh vật.
Huyền phù vi khuẩn sau đó được ly tâm trong 15 phút ở 5000 rpm để tách sinh khối ra khỏi môi trường rồi rửa sinh khối vi sinh vật bằng 3 lần nước cất vô trùng và pha loãng bằng nước cất vô trùng đến độ đục tương đương 0.5 MC Farland. Huyền phù vi khuẩn này được dùng để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn.
Thực nghiệm:
Dùng micropipet hút 100µl vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 108 CFU/ml), sau đó tiến hành cấy chang trên bề mặt đĩa thạch MHA, chờ khô bề mặt. Đánh số cho đĩa petri từ 1 đến 7. Đĩa giấy 6 mm đã được vô trùng được thấm vào dịch cao đã được pha theo từng nồng độ lần lượt là 1600, 800, 400, 200 mg/ml và lấy ra đặt lên mặt đĩa thạch đã cấy chang vi khuẩn (số 1: 1600 mg/ml; số 2: 800 mg/ml; số 3: 400 mg/ml; số 4: 200 mg/ml), đè nh để đĩa giấy cố định trên mặt thạch. Hai đối chứng dương là kháng sinh Tetrcyline và Chloramphenicol được thấm vào đĩa giấy và đặt lên đĩa thạch (số 5: Tetracyline; số 6: Chloramphenicol). Đĩa giấy ở giữa thấm dung dịch đối chứng âm DMSO 5% (số 7).
Sau đó đem nuôi ở 37 oC trong 16 – 18 giờ, riêng Staphylococcus aureus
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả chiết tách cao vỏ lá Lô hội
Qua quá trình thực nghiệm quy trình chiết cao vỏ lá Lô hội bằng Soxhlet:
Kết quả thí nghiệm xác định dung môi chiết:
Bảng 3. 1: Khối lượng cao vỏ lá Lô hội thu được từ 5 dung môi chiết
Dung môi Thời gian
Etyl
Acetat Ether Methanol Ethanol
96o Hexan
6h 0.73 g 0.56 g 2.53 g 2.37 g 0.47 g
Hình 3. 1: Biểu đồ ảnh hưởng của các dung môi đến hiệu suất cao chiết cao vỏ lá Lô Hội
Nhận xét:Khả năng hòa tan của các chất có hoạt tính sinh học trong lá Lô hội khác nhau tùy thuộc vào loại dung môi. Ở các thời gian khác nhau, thì dịch chiết thu được có thành phần các hợp chất hòa tan khác nhau.
Khi chiết vỏ lá Lô hội với 5 dung môi khác nhau bằng hệ thống Soxhlet ở thời gian 6h với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 25:1 thì lượng cao vỏ lá Lô hội thu được cao nhất là chiết với dung môi Methanol có khối lượng cao là 2.53 g (H = 25.3%). Dung môi có lượng cao vỏ lá Lô hội cũng không kém Methanol là Ethanol 96% có lượng cao là 2.37g (H = 23.7%). Lượng cao vỏ lá Lô hội thu được thấp nhất
khi chiết với Hexan có khối lượng cao là 0.47 g (H = 4.7 %). Hai dung môi còn lại