Phương pháp phân lập chất

Sắc ký cột (CC) được thực hiện trên silica gel (Kieselgel 60, 70–230 mesh và 230–400 mesh, Merck), silica gel pha đảo YMC (ODS-A, 12 nm, S-150 mm, YMC Co., Ltd., Nhật Bản), gel polyme xốp (Diaion® HP-20, 20–60 mesh, Mitsubishi

26 Chemical, Tokyo, Japan), nhựa Sephadex ™ LH-20 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Thụy Điển) và YMC RP-18 (30–50 µm, Fuji Silysia Chemical).

Sắc ký lớp mỏng (TLC) sử dụng các tấm silica gel 60 F254 (1.05554.0001, Merck) và RP-18 F254S (1.15685.0001, Merck) tráng trước và phát hiện chất bằng cách phun dung dịch nước H2SO4 10% và đun nóng trong 1,5-2 phút.

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các chất

Cấu trúc các hợp chất phân lập được xác định dựa vào các thông số vật lý kết hợp với các phương pháp phổ hiện đại.

2.2.2.1. Góc quay cực riêng

của một hợp chất quang hoạt chứa các trung tâm bất đối, được đo trên máy JASCO P-2000 Polarimeter (Tokyo, Nhật Bản) tại Viện Hóa sinh biển, VAST.

2.2.2.2. Phổ khối lượng (MS)

Phổ HR-ESI-MS: Phổ khối lượng phân giải cao cho phép xác định pic ion mảnh hay phân tử có độ chính xác cao. HR-ESI-MS đo trên máy Agilent 6530 Accurate- Mass spectrometer (CA, Mỹ) tại Viện Hóa học, VAST.

2.2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

- Phổ NMR đo trên máy Bruker AVANCE III HD 500 (Brucker, Đức), Bruker AVANCE III HD 500 (MA, Mỹ) FT-NMR của Viện Hóa học, VAST, máy đo phổ JEOL JNM-AL 400 MHz. Chất nội chuẩn là TMS (Tetramethyl silane).

- Các kỹ thuật phổ NMR được sử dụng bao gồm:

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR.

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY.

+ Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi DMSO-d6, methanol-d4, chloroform-d1,pyridine-d5. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, trên nguyên tắc là dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu đo.

2.2.2.4. Phổ lưỡng sắc tròn (CD)

Phổ CD cho phép xác định cấu trúc tuyệt đối của các hợp chất phân lập từ tự nhiên có các trung tâm carbon bất đối, được đo trên máy Chirascan spectrometer (Applied Photophysics, Vương quốc Anh) tại Viện Hóa sinh biển, VAST.

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.2.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào và ức chế sinh trưởng tế bào ung thư

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các mẫu dịch chiết và các chất sạch được thực hiện trên một số dòng tế bào ung thư: HepG2 (ung thư gan), SK-Mel-2 (ung thư da melanoma), MCF7 (ung thư vú) tại phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Khả năng ức chế sinh trưởng tế bào ung thư trên các dòng tế bào HCT-15 (ung thư đại tràng), NUG-3 (ung thư dạ dày), NCI-H23 (ung thư phổi), ACHN (ung thư thận), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt), MDA-MB-231 (ung thư vú) được thực hiện tại Phòng thí nghiệm hóa học các sản phẩm tự nhiên biển, Viện Khoa học và Công nghệ Đại dương Hàn Quốc, Busan, Hàn Quốc.

Hóa chất sử dụng:

27 - Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pipette, eppendorf, máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-Rad), đầu đọc vi tấm VersaMax (LLC, Sunnyvale, CA, USA)

- Chất tham khảo: Ellipticine (Sigma, USA), adriamycin (Sigma, USA). - Các hóa chất thông thường khác

- Các dòng tế bào ung thư do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia và American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) cung cấp.

❖ Nguyên lý của phép thử [56]:

Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks.

Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Các mẫu thử nghiệm được hòa tan trong DMSO và được chuẩn bị ở các nồng độ khác nhau (0,5; 2; 10; 20 và 40 μM) bằng cách pha loãng tương ứng với môi trường tăng trưởng

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

- Chất thử (10 L) đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm 190 L tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất thử trong giếng là 100 g/mL, 20 g/mL; 4 g/mL; 0,8 g/mL.

- Ủ trong tủ ấm 48 giờ. Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (190 L) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng trichloracetic acid 50% (50 µg/mL) – TCA.

- Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB 0.4% trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid 1% rồi để khô ở nhiệt độ phòng. - Thuốc nhuộm liên kết với protein được chiết với base Tris 10 mM ở pH 10,5 để xác định mật độ quang học.

- Đọc kết quả OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy đọc ELISA (Bio-Rad) và đầu đọc vi tấm VersaMax.

- Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

[OD (chất thử) – OD (ngày 0)] x 100 % ức chế = 100% -

OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0) - Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác.

- Ellipticine ở các nồng độ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL được sử dụng như là chất đối chứng dương trong thử nghiệm gây độc tế bào; adriamycin được sử dụng làm chất đối chứng dương trong thử nghiệm ức chế sinh trưởng tế bào ung thư.

28 - DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4. - Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết được coi có hoạt tính tốt với IC50  20 μg/mL, trong khi chất tinh khiết được coi có hoạt tính tốt (hit compound) khi IC50  5 μM [59].

Trong đó:

HighConc/LowConc: chất thử ở nồng độ cao/chất thử ở nồng độ thấp HighInh%/LowInh%: % ức chế ở nồng độ cao/% ức chế ở nồng độ thấp

2.2.3.2. Hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO)

Hoạt tính ức chế sản sinh NO của các dịch chiết và các chất sạch được thực hiện theo phương pháp của Griess trên đại thực bào của chuột (RAW264.7 đối với các chất từ cây Na rừng (thực hiện tại khoa Dược - Đại học Tôn Đức Thắng - Thành phố Hồ Chí Minh và BV-2 với các chất từ cây Thông đất, thực hiện tại Đại học Dược Wonkwang, Hàn Quốc) kích thích bởi LPS [57].

a. Nguyên lý chung:

Gốc tự do nitric oxide (•NO) được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau. Khi xuất hiện các đáp ứng viêm, dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thực bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thường được sản sinh với lượng lớn.

*Phương pháp gián tiếp để xác định •NO là xác định màu sắc của sản phẩm của nó (nitrate và nitrite). Trong phản ứng này, nitrate (NO3-) chuyển thành nitrite (NO2-), do tác động của nitrate reductase.

Khi xử lý với thuốc thử Griess, nitrite chuyển thành màu hồng theo phản ứng sau:

*Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh giá khả năng sống sót của tế bào. Ở các tế bào sống, hệ enzym oxidoreductase hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng formazan không hoà tan, màu tím đậm theo phương trình phản ứng sau:

29 Do vậy, tỉ lệ tế bào sống sót được suy ra từ lượng formazan tạo thành từ MTT. Lượng formazan tạo thành được hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo độ hấp thụ ở bước sóng 570 mm. Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử nghiệm được suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào [61].

b. Phương pháp thực hiện

Tế bào (RAW264.7 hoặc BV-2) được nuôi cấy với nồng độ 5 x 105 tế bào/mL trong môi trường DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin G (100 U/mL), streptomycin (100 mg/L) và L-glutamine (2 mM). Sau đó, môi trường được thay thế bằng môi trường mới chứa 100 g/mL LPS và các hợp chất thử ở nhiều nồng độ khác nhau, giữ ổn định trong 24 h. Sự sản sinh NO được đánh giá dựa vào sự tích tụ nitrite trong dịch nổi của tế bào sử dụng thuốc thử Griess. Dung dịch DMSO 1% được sử dụng làm mẫu trắng, butein, dexamethasone, sulfuretin được sử dụng làm mẫu đối chứng [57].

NaNO2 ở các nồng độ khác nhau được sử dụng để xây dựng đường chuẩn. Độ hấp thụ được đo ở 570 nm.

Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá các hoạt tính in vitro được bổ sung dung dịch MTT (0,5 mg/mL pha trong PBS), ủ 4 h ở 37oC và 5% CO2. Sau đó hút bỏ hết môi trường trên bề mặt, kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ được đo ở 570 nm.

c. Tính toán - % ức chế NO % ức chế = x 100 Trong đó: A-C: nồng độ NO2- (µM) A: LPS (+) mẫu (-) B: LPS (+) mẫu (+) C: LPS (-) mẫu (-)

Khả năng ức chế nitrite cho nồng độ ức chế trung bình IC50 – giá trị được tính toán bằng chương trình GraphPad Prism, version 8.4.0 (GraphPad Software Inc., USA)

- Tính giá trị CS % (% Cell Survival)

Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, Giá trị CS (%) được tính theo công thức:

CS% = ± 

30 OD: mật độ quang

σ: độ lệch tiêu chuẩn được tính theo công thức:

Trong đó: xi: giá trị OD tại giếng i, : giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại

- Tính giá trị IC50

Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng trên 5 nồng độ thử nghiệm. Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism 8.4.0.

% ức chế tế bào = x 100

Trong đó:

HighConc/LowConc: chất thử ở nồng độ cao/chất thử ở nồng độ thấp HighInh%/LowInh%: % ức chế ở nồng độ cao/% ức chế ở nồng độ thấp.

2.2.3.3. Phương pháp xác định cấu hình đường bằng thủy phân acid

Quy trình thủy phân đường bằng acid để xác định cấu hình của đường được thực hiện theo phương pháp đã công bố trước đây [58, 59, 60].

Hợp chất cần thử (1,0 mg) được thủy phân bằng cách đun nóng trong 100 μL dung dịch H2SO4 10% ở 80 °C trong 3 giờ, sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng và pha loãng với 4 mL nước. Hỗn hợp sau phản ứng được trung hòa bằng BaCO3, và lọc, sau đó dịch lọc được chiết bằng ethyl acetate (3 × 4 mL). Lớp nước được cô đặc để thu được cặn đường, hòa tan cặn đường trong 1 mL pyridine và đun nóng với 6 mg L-cysteine methyl ester ở 60 oC trong 60 phút, sau đó thêm phenylisothiocyanate (0,1 mL) vào hỗn hợp phản ứng và tiếp tục phản ứng ở 60 oC trong 60 phút để tạo ra dẫn xuất arylthiocarbamate theo phản ứng sau:

0,7 mg sản phẩm được hòa tan trong acetonitrile và được phân tích bằng HPLC pha đảo tiêu chuẩn (Kinetex C18: 4,6 mm x 250 mm, 5 μm) với pha động là hỗn hợp 20% acetonitrile trong nước ở tốc độ dòng 0,8 mL/phút, phát hiện bằng detector UV (ở 250 nm) ở điều kiện phân tích là 0 phút (80% nước/20% ACN) - 50 phút (20% nước/80% ACN). Các đường với cấu hình khác nhau sẽ cho sản phẩm có thời gian lưu khác nhau khi phân tích trên HPLC.

31

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Phân lập các hợp chất từ loài Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic.

Serm.)

3.1.1. Quy trình phân lập các chất

Toàn cây Thông đất sau khi thu hái về được rửa sạch, phơi khô và nghiền nhỏ thu được 5,2 kg bột dược liệu khô. Lượng bột này được ngâm chiết với methanol ở nhiệt độ phòng (3 lần x 10 L) trong 24 h. Dịch chiết methanol được đem đi cô quay thu được cặn chiết tổng (360 g). Cặn chiết này đem hòa vào 2 L nước và chiết phân bố lần lượt với n-hexane, ethyl acetate và cô quay dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết n-hexane (H), cặn chiết ethyl acetate (E) và dịch chiết nước (W). Sơ đồ ngâm chiết được thể hiện trên hình 3.1.

Hình 3.1. Sơ đồ ngâm chiết thân cây Thông đất

Dịch nước được phân tách trên cột Diaion HP-20 và rửa giải với hệ dung môi MeOH/nước với tỷ lệ lần lượt là 100/1; 50/50 và 100/0) thu được 3 phân đoạn W1- 3.

Phân đoạn W2 (3,2 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP18 sử dụng hệ dung môi rửa giải là MeOH/nước (1/2 đến 2/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ (W2A-W2D).

Hợp chất LC1 (1,0 mg) thu được từ phân đoạn W2A tinh chế trên cột pha đảo RP18 hệ MeOH/acetone/H2O (8/1/1) và chạy qua cột Sephadex™ LH-20.

Phân đoạn W2C được chạy sắc ký cột pha thường với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/acetone/H2O (6/5/0,04/0,1) thu được 3 phân đoạn nhỏ W2C1- W2C3.

32 Hợp chất LC18 (3,0 mg) thu được bằng cách tinh chế phân đoạn W2C1 trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là EtOAc/MeOH/H2O (7/1/0,1) và qua cột SephadexTM LH-20 sử dụng hệ dung môi MeOH/H2O (1/1).

Tinh chế phân đoạn W2C3 (150 mg) trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi EtOAc/MeOH/H2O (7/1/0,1) và sắc ký cột pha đảo RP18 hệ dung môi MeOH/H2O (1/3 và 1/2) thu được hợp chất LC19 (4,0 mg) và LC20 (13,0 mg) và LC2 (4,0 mg). Phân đoạn W2D (640,0 mg) được tiến hành sắc ký cột pha thường hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/acetone/H2O (6,5/1/0,04/0,1) và cột Sephadex™ LH-20 rửa giải bằng hệ dung môi MeOH/acetone/H2O (8/1/1) thu được hợp chất LC3 (3,0 mg) và

LC4 (24,0 mg).

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập dịch nước của cây Thông đất

Cặn chiết Ethyl acetate (60 g) được tách thành 4 phân đoạn nhỏ E1-E4 bằng cách sắc ký cột pha thường sử dụng hệ dung môi n-hexane/EtOAc (10/1 đến 0/1).

Phân đoạn E3 (30 g) được tiến hành sắc ký cột pha thường hệ dung môi n- hexane/EtOAc (20/1 đến 1/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ E3A-E3D.

Tinh chế phân đoạn E3B (7,0 g) trên cột sắc ký pha đảo RP18 hệ dung môi acetone/H2O (4/3) thu được hợp chất LC6 (2,5 mg) và LC12 (9,0 mg).

Phân đoạn E3C (14,0 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo hệ dung môi MeOH/H2O (1/1) và tinh chế thêm trên cột sắc ký pha thường hệ dung môi CH2Cl2/acetone (6/1) thu được các hợp chất LC5 (10,0 mg); LC7 (2,0 mg); LC8

(4,0 mg) và LC9 (5,0 mg);

Tinh chế phân đoạn E3D (2,8 g) trên cột sắc ký pha đảo RP18 hệ dung môi acetone/H2O (1/3) và tinh chế thêm trên cột silica gel pha thường hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (20/1) thu được hợp chất LC16 (10,0 mg) và LC17 (5,0 mg)

Tiến hành sắc ký cột pha thường phân đoạn E4 (15g) hệ dung môi n- hexane/EtOAc (6/1 đến 1/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ E4A-E4D.

Tinh chế phân đoạn E4A (1,4 g) trên sắc ký cột pha đảo RP18 hệ dung môi MeOH/H2O(8/1) và cột Sephadex™ LH-20 sử dụng hệ MeOH/H2O (1/1) thu được hợp chất LC10 (10,0 mg); LC11 (50,0 mg); LC13 (15,5 mg) và LC14 (5,0 mg).

33 Phân đoạn E4D (1,0 g) được tinh chế trên sắc ký cột pha đảo RP18 với hệ dung môi acetone/H2O và tiếp tục sắc ký cột pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (15/1) thu được hợp chất LC15 (6,0 mg).

Hình 3.3. Sơ đồ phân lập cặn EtOAc của cây Thông đất

3.1.2. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ loài Thông đất

3.1.2.1. Hợp chất LC1: Lycocernuaside E (hợp chất mới)

Chất bột màu trắng

HR-ESI-MS: m/z 559,1587 [M+Cl]−

KLPT chính xác (tính toán) [C25H32O12Cl]-: 559,1588 Công thức phân tử: C25H32O12, Mw = 524 g/mol

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.1

3.1.2.2. Hợp chất LC2: Lycocernuaside A

Chất bột màu trắng

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.2

3.1.2.3. Hợp chất LC3: Bombasin 4-O-β-D-glucopyranoside

Chất bột màu trắng

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.3

3.1.2.4. Hợp chất LC4: Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-

glucopyranoside

Chất bột màu trắng

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.4

3.1.2.5. Hợp chất LC5: Cedrusin

Chất rắn không màu

34

3.1.2.6. Hợp chất LC6: Lycernuic B (hợp chất mới)

Chất bột màu trắng

Góc quay cực riêng: − 54.3 (c 0,04, MeOH) HR-ESI-MS: m/z 595,4002 [M-H]-

KLPT chính xác (tính toán) [C37H55O6]-: 595,4004 CTPT: C37H56O6 Mw = 596 g/mol

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.6

3.1.2.7. Hợp chất LC7: Lycocernuic ketone F (hợp chất mới)

Chất bột màu trắng

Góc quay cực riêng: − 31,6 (c 0,1; MeOH). HR-ESI-MS: m/z 473,3628 [M+H]+

KLPT chính xác (tính toán) [C30H49O4]+: 473,3625 CTPT: C30H48O4 Mw = 472 g/mol

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.7

3.1.2.8. Hợp chất LC8: Lycernuic ketone C

Chất rắn không màu