Từ toàn bộ thân của loài Thông đất đã phân lập được 20 hợp chất, trong đó có 3 hợp chất mới. Cấu trúc của các hợp chất được xác định như sau:
4.1.1. Hợp chất LC1: Lycocernuaside E (hợp chất mới)
Hình 4.1.1.a. Cấu trúc của hợp chất lycocernuaside D và LC1
Hợp chất LC1 thu được ở dạng bột màu trắng.
Công thức phân tử của LC1 được xác định là C25H32O12, dựa trên phổ HR-ESI- MS, cho pic ion giả phân tử [M+Cl]- tại m/z 559,1587 (tính toán cho C25H32O12Cl-; 559,1588).
Hình 4.1.1.b. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất LC1
Phổ 1H-NMR của LC1 cho thấy nó thuộc bộ khung neolignan, cụ thể gồm sáu tín hiệu proton của hai vòng thơm thế ba ở các vị trí 1,3,4 với δH 7,14 (1H; d; J = 1,5 Hz, H-2); 7,13 (1H; d; J = 8,5 Hz; H-5) và 6,99 (1H; dd; J = 2,0; 8,5 Hz; H-6), cũng như δH 7,56 (1H; d; J = 2,0 Hz, H-2′); 7,10 (1H; d; J = 8,5 Hz; H-5′); 7,60 (1H; dd;
J = 2,0; 8,5 Hz; H-6′) và, hai nhóm oxymethine ở δH 4,97 (1H; d; J = 4,5 Hz; H-7) và 4,61 (1H; d; J = 5,5 Hz; H-8), một nhóm oxymethylene ở δH 3,60 (1H; dd; J = 6,0; 12,0 Hz; H-9a); 3,87 (1H; m; H-9b), hai nhóm methoxy ở δH 3,92 (3H; s; 3′- OCH3) và 3,85 (3H; s; 3-OCH3), một proton anome ở δH 4,88 (1H; tín hiệu chồng chập, H-1′′), và một nhóm methyl acetyl hóa ở δH 2,57 (3H; s).
Cấu hình β-D-glucoside được khẳng định khi so sánh giá trị δCcủa LC1 với tài liệu tham khảo [61].
41
Hình 4.1.1.c. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất LC1 đo trong methanol-d4
Phổ 13C-NMR của LC1 cho thấy sự xuất hiện của 25 nguyên tử carbon, bao gồm sáu nguyên tử carbon thuộc một đơn vị β-glucopyranosyl ở δC 102,9 (CH; C-1′′), 74,9 (CH; C-2′′); 78,2 (CH; C-3′′); 71,4 (CH; C-4′′); 77,8 (CH; C-5′′) và 62,5 (CH2; C-6′′), điều này được làm sáng tỏ qua các tương quan trên phổ HSQC và HMBC. Ngoài ra là tín hiệu của 3 nhóm methyl, 1 nhóm methylene, 8 nhóm methine và 7 carbon không chứa proton.
Hình 4.1.1.d. Phổ 13C-NMR của hợp chất LC1 đo trong methanol-d4
42 Tương quan HMBC giữa H-1′′ (δH 4,90) và C-4 (δC 147,5) xác nhận rằng đơn vị glucose được liên kết tại C-4. Vị trí của hai nhóm methoxy tại C-3 và C-3′ được xác định bởi các pic giao trên HMBC từ 3-OCH3 (δH 3,85) đến C-3 (δC 150,6) và từ 3′- OCH3 (δH 3,92) đến C-3′ (δC 151,1).
Hình 4.1.1.e. Phổ HSQC của hợp chất LC1 đo trong methanol-d4
Hình 4.1.1.f. Phổ HMBC của hợp chất LC1 đo trong methanol-d4
Cấu hình tương đối của gốc aglycone trong LC1 được khẳng định là erythro dựa vào hằng số tương tác bé giữa H-7 và H-8 (3J7,8 = 4,5 Hz) và so sánh dữ liệu 1H và
43 13C-NMR với các dữ liệu của neolignan lycocernuaside D được báo cáo trước đây [17, 62], điểm khác biệt là sự xuất hiện của một nhóm glucoside tại vị trí C-4 trong
LC1. Do đó, cấu trúc của LC1 được xác định như trong hình 4.1.1.g, đây là hợp chất mới và được đặt tên là lycocernuaside E (chi tiết phổ xem phụ lục 1).
Hình 4.1.1.g. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của LC1 Bảng 4.1.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất LC1 và hợp chất tham khảo
Vị trí #δC δCa,b DEPT δHa,c độ bội, (J= Hz) HMBC 1 133,3 137,3 C - 2 111,5 112,5 CH 7,14 d (1,5) 1, 4, 6, 7 3 147,5 150,6 C - 4 146,1 147,5 C - 5 115,2 117,6 CH 7,13 d (8,5) 3 6 119,5 120,6 CH 6,99 dd (2,0; 8,5) 2, 4 7 71,6 73,5 CH 4,97 d (4,5) 1, 2, 6, 8, 9 8 84,1 85,4 CH 4,61 d (5,5) 1, 7, 9, 4′ 9 60,7 62,0 CH2 3,60 dd (6,0; 12,0)/3,87 m 8 1′ 153,5 131,9 C - 2′ 111,4 112,4 CH 7,56 d (2,0) 4′, 6′, 7′ 3′ 149,5 151,1 CH - 4′ 130,1 154,5 C - 5′ 113,8 115,6 CH 7,10 d (8,5) 3′, 4′ 6′ 123,3 124,6 CH 7,60 dd (2,0; 8,5) 2′, 4′, 7′ 7′ 196,7 199,5 C - 8′ 26,8 26,3 CH3 2,57 s 1′, 7′ 3-OCH3 55,9 56,7 CH3 3,85 s 3 3′-OCH3 56,1 56,6 CH3 3,92 s 3′ 1′′ 102,9 CH 4,88 (tín hiệu chồng chập) 4 2′′ 74,9 CH 3,48 m 3′′ 78,2 CH 3,41 m 4′′ 71,4 CH 3,41 m 5′′ 77,8 CH 3,48 m 6′′ 62,5 CH2 3,70 dd (5,0; 12,0)/3,87 m
44
4.1.2. Hợp chất LC2: Lycocernuaside A
Hình 4.1.2: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của LC2
Hợp chất LC2 thu được dạng bột màu trắng.
Phổ 1H-NMR cho thấy các tín hiệu của một vòng thơm thế 3 ở các vị trí 1,3,4 tại [δH 7,05 (br s; H-2); 7,17 (d; J = 8,0 Hz; H-5) và 6,96 (br d; J = 8,0 Hz; H-6)] và một vòng thơm thế 4 ở các vị trí 1,3,4,5 tại δH 6,78 (s; H-2′); 6,76 (s; H-6′). Ngoài ra là các tín hiệu proton của propanoic acid tại δH 2,86 (t; J = 7,5 Hz; H-7′); 2,58 (t; J = 7,5 Hz; H-8′) và một proton oxymethine tại δH 5,57 (d; J = 6,0 Hz; H-7). Các nhóm methoxy được quan sát thấy tại δH 3,85 và 3,88.
Bên cạnh đó, các tín hiệu đặc trưng của một đơn vị glucose cũng được quan sát thấy tại δH 4,90 (d; J = 7 Hz, H-1′′) và các tín hiệu ở vùng 3,50-3,87 ppm.
Phổ 13C-NMR cho thấy sự có mặt của 26 tín hiệu carbon bao gồm 12 carbon thơm, bên cạnh đó là các tín hiệu của nhóm oxymethine tại δC 88,5 (C-7); nhóm methine tại δC 55,6 (C-8), các nhóm methylene tại δC 32,0; 37,5(C-7′, C-8′), và nhóm methoxy tại δC 56,7; 56,8 (3′-OCH3; 3-OCH3).
Các dữ liệu trên cho thấy LC2 có cấu trúc là một neolignan glycoside dihydrobenzofuran [14].
Bảng 4.1.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất LC2 và hợp chất tham khảo
Vị trí #δC δCa,b DEPT δHa,c độ bội, (J= Hz) HMBC 1 129,6 129,7 C - 2 111,2 111,2 CH 7,05 br s 3, 4, 6, 7 3 150,9 151,0 C - 4 147,5 147,6 C - 5 118,1 118,1 CH 7,17 d (8,0) 6 119,4 119,4 CH 6,96 br d (8,0) 2, 4, 7, 8 7 88,4 88,5 CH 5,57 d (6,0) 1, 2, 6, 8, 9 8 55,5 55,6 CH 3,51 m 1, 7, 9 9 65,2 65,0 CH2 3,87 m/3,77 m 1′ 136,1 136,0 C - 2′ 114,1 114,2 CH 6,78 s 3′, 4′, 6′, 7′ 3′ 138,5 138,3 C - 4′ 147,7 147,8 C - 5′ 145,2 145,3 C - 1′, 3′, 4′
45 6′ 117,8 117,9 CH 6,76 s 2′, 4′, 7′ 7′ 32,3 32,0 CH2 2,86 t (7,5) 1′, 2′, 6′, 8′, 9′ 8′ 38,1 37,5 CH2 2,58 t (7,5) 1′, 9′ 9′ 178,1 - C - 3-OCH3 56,8 56,8 CH3 3,88 s 3 3′-OCH3 56,7 56,7 CH3 3,85 s 3′ 1′′ 102,8 102,8 CH 4,90 d (7,0) 4′ 2′′ 74,8 74,9 CH 3,51 m 3′′ 77,8 77,9 CH 3,50 m 4′′ 71,3 71,4 CH 3,46 m 5′′ 79,4 78,2 CH 3,47 m 6′′ 62,4 62,5 CH2 3,70 d (11,0)/3,87 m
#δC của lycocernuaside A [14] đo trong methanol-d4, amethanol-d4, b125 MHz, c500 MHz
Trên phổ HMBC cho thấy các tương tác giữa H-6/H-2 đến C-7 cho phép xác định nhóm oxymethine được gắn vào vị trí C-1 và tương tác giữa H-7′/H-8′ đến C- 1′/C-9′ khẳng định phần propionic acid được gắn vào C-1′. Vị trí các nhóm methoxy được khẳng định dựa vào tương quan HMBC của các proton nhóm methoxy đến C- 3 và C-3′. Tương quan HMBC của H-1″ (δH 4,90) với C-4 (δC 147,6) chỉ ra rằng đơn vị glucopyranosyl được liên kết với oxy ở C-4, và giá trị J của proton anome (J = 7,0 Hz, H-1′′) đã khẳng định cấu hình β-glucoside. Cấu hình của C-7 và C-8 được khẳng định là trans do giá trị hằng số tương tác đặc trưng của chúng J7,8= 6,0 Hz.
So sánh các dữ kiện phổ NMR của hợp chất LC2 với hợp chất lycocernuaside A đã được công bố [14], nhận thấy có sự phù hợp về dữ kiện phổ (bảng 4.1.2). Điều này cho phép xác định hợp chất LC2 là lycocernuaside A (chi tiết phổ xem phụ lục 2).
4.1.3. Hợp chất LC3: Bombasin 4-O-β-D-glucopyranoside
Hình 4.1.3: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của LC3
Hợp chất LC3 thu được dạng bột màu trắng.
Các dữ kiện phổ NMR của hợp chất LC3 có sự tương đồng với các dữ kiện phổ của hợp chất LC2 cho thấy nó là một neolignan glycoside dihydrobenzofuran. Sự khác biệt nằm ở vị trí C-7' và C-8', đồng thời ở LC3 không còn tín hiệu của carbon nhóm carboxyl tại δC 178,1 (C-9') trong LC2.
46 Giá trị độ chuyển dịch hóa học δC 199,3 gợi ý sự có mặt của nhóm carbonyl tại vị trí C-7', và nhóm CH3 tại δC 26,5 (C-8'). Điều này được khẳng định thêm khi phân tích các tương quan trên HSQC và HMBC.
Bảng 4.1.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất LC3 và hợp chất tham khảo
Vị trí #δC δCa,b DEPT δHa,c độ bội, (J= Hz) HMBC 1 134,6 132,8 C - 2 110,5 111,3 CH 7,05 d (2,0) 3, 4, 6, 7 3 149,1 151,1 C - 4 146,4 147,9 C - 5 115,5 113,9 C 7,17 d (8,5) 6 118,2 118,1 CH 6,94 dd (2,0; 8,5) 2, 4, 7, 8 7 88,0 89,8 CH 5,70 d (6,0) 1, 2, 6, 8, 9 8 52,5 54,7 CH3 3,46 m 5', 1, 9 9 62,6 62,5 C 3,77-3,87 m 5', 7, 8 1′ 131,1 130,3 C - 2′ 112,2 113,9 CH 7,57 d (1,5) 3', 4', 6', 7' 3′ 143,6 145,6 C - 4′ 152,0 147,8 C - 5′ 129,4 118,1 CH - 1', 3', 4' 6′ 118,8 119,4 CH 7,64 s 2', 4', 7' 7′ 196,2 199,3 C - 1', 2', 6', 8' 8′ 26,5 26,5 CH3 2,58 s 1', 7' 3-OCH3 55,8 56,8 CH2 3,84-3,92 m 3 3′-OCH3 55,8 56,8 CH3 3,84-3,92 m 3' 1′′ 100,0 102,7 CH3 4,91 d (7,0) 4 2′′ 73,1 74,9 CH 3,40-3,42 m 3′′ 76,6 77,9 CH 3,70-3,72 m 4′′ 69,6 71,4 CH 3,69-3,71 m 5′′ 76,9 78,2 CH 3,40-3,42 m 6′′ 60,6 62,5 CH2 3,70-3,87 m
#δC của bombasin 4-O-β-D-glucopyranoside [63] đo trong DMSO-d6, amethanol-d4, b125 MHz, c500 MHz
So sánh dữ kiện phổ của LC3 với hợp chất bombasin 4-O-β-D-glucopyranoside (lycocernuside C)được công bố trong tài liệu [65] nhận thấy có sự phù hợp về các tín hiệu phổ (bảng 4.1.3) cho phép xác định hợp chất LC3 là bombasin 4-O-β-D-
47
4.1.4. Hợp chất LC4: Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside glucopyranoside
Hình 4.1.4: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của LC4
Hợp chất LC4 thu được dạng chất bột màu trắng.
Các dữ kiện phổ NMR của hợp chất LC4 cho thấy nó tương tự như hợp chất
LC2. Điểm khác biệt duy nhất tại vị trí C-9'. Trong LC2, vị trí C-9' là một nhóm carboxyl với giá trị độ chuyển dịch hóa học đặc trưng δC 178,1. Tuy nhiên trong
LC4, tín hiệu C-9' đã được chuyển xuống vùng trường cao tại δC 62,2, gợi ý sự có mặt của một nhóm methylene liên kết với oxy. Điều này được khẳng định nhờ phổ 1H-NMR và HSQC khi tín hiệu C-9' được gắn tương ứng với tín hiệu proton tại δH 3,77 (dd; J = 7,5; 11,0)/3,87 m, cho thấy tại C-9' là nhóm hydroxymethylene.
Bảng 4.1.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất LC4 và hợp chất tham khảo
Vị trí #δC δCa,b DEPT δHa,c mult, (J= Hz) HMBC 1 136,8 138,3 C - 2 111,3 111,2 CH 6,75 s 3, 4, 6, 7 3 147,2 150,9 C - 4 150,2 147,6 C - 5 116,5 118,1 C - 6 118,9 119,4 CH 6,73 s 2, 4, 7, 8' 7 87,9 88,4 CH 2,64 t (8,0) 1, 2, 6, 8, 9 8 55,1 55,6 CH2 1,83 m 1, 7, 9 9 64,4 65,0 CH2 3,58 t (7,0) 7, 8 1′ 129,9 137,1 C - 2′ 113,7 114,2 CH 7,05 br s 3', 4', 6' 3′ 144,6 145,2 C - 4′ 147,6 147,5 C - 5′ 136,2 129,6 CH 7,15 d (8,5) 1', 3', 4' 6′ 117,5 117,9 CH 6,95 d (8,5) 2', 4', 7' 7′ 32,6 32,9 CH 5,57 d (6,0) 5, 1', 2', 6', 8', 9' 8′ 36,0 35,8 CH 3,46 m
48 9′ 61,5 62,2 CH2 3,77 dd (7,5; 11,0)/ 3,87 m 5, 7', 8' 3-OCH3 56,3 56,8 CH3 3,89 s 3 3′-OCH3 55,9 56,7 CH3 3,85 s 3' 1′′ 102,3 102,8 CH 4,90 d (7,0) 4' 2′′ 74,9 74,9 CH 3,50 m 3′′ 78,8 78,2 CH 3,41 m 4′′ 71,2 71,3 CH 3,41 m 5′′ 78,5 77,8 CH 3,48 m 6′′ 62,4 62,5 CH2 3,69 dd (3,0; 12,0)/3,87 m
#δC của dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β -D –glucopyranoside [63] đo trong pyridine-d5, amethanol-d4, b125 MHz, c500 MHz
Khi so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-
O-β-D–glucopyranoside đã được công bố trước đó [63], hợp chất LC4 có sự phù hợp về dữ kiện phổ (bảng 4.1.4), điều này cho phép khẳng định LC4 là
dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β -D –glucopyranoside (chi tiết phổ xem phụ lục 4).
4.1.5. Hợp chất LC5: Cedrusin
Hình 4.1.5: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của LC5
Hợp chất LC5 thu được dạng chất rắn không màu.
Các dữ kiện phổ của LC5 cho thấy sự tương đồng với LC4 cho thấy nó có cùng cấu trúc. Điểm khác biệt là phân tử đường trong LC4 được thay thế bằng nhóm hydroxyl trong LC5 và tín hiệu methoxy đính với C-3' ở LC4 được thay thế bằng nhóm hydroxyl ở LC5.
Thật vậy, các tín hiệu đặc trưng của một đơn vị đường δH 4,90 (d; J = 7,0 Hz, H- 1′′) và các tín hiệu ở vùng 3,41-3,87 ppm trong LC4 đã không xuất hiện trên LC5. Đồng thời vị trí C-4 có độ chuyển dịch hóa học δC 114,4 ppm cho thấy nó liên kết với nhóm hydroxyl.
Đồng thời trên các phổ NMR một chiều và hai chiều đã không thấy sự xuất hiện của nhóm methoxy đính vào vị trí C-3'. Giá trị độ chuyển dịch hóa học δC 141,9 tại C-3' cho phép khẳng định nó gắn với một nhóm hydroxyl.
Bảng 4.1.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất LC5 và hợp chất tham khảo
Vị trí #δC δCa,b DEPT δHa,c độ bội, (J= Hz) HMBC 1 134,61 135,1 C - 2 110,82 110,6 CH 7,00 d (1,5) 3, 4, 6, 7 3 149,20 149,1 C - 4 147,86 147,4 C - 5 116,41 116,1 C 6,78 d (8,0) 6 120,10 119,7 CH 6,86 dd (1,5; 8,0) 2, 4, 7, 8 7 89,8 88,7 CH 5,51 d (6,0) 1, 2, 6, 8, 9
49 8 54,83 55,8 CH2 3,47 dd (6,0; 12,0) 1, 7, 9 9 64,76 65,2 CH2 3,77 dd (7,5; 12,0)/ 3,84 dd (5,5; 12,0) 7, 8 1' 131,07 129,8 C - 2' 116,86 117,0 CH 6,58 d (1,5) 3', 4', 6' 3' 141,56 141,9 C - 4' 145,98 146,5 C - 5' 136,56 136,7 CH - 1', 3', 4' 6' 115,69 116,7 CH 6,63 s 2', 4', 7' 7' 35,62 35,8 CH 2,58 t (8,0) 1', 2', 6', 9' 8' 31,91 32,7 CH 1,81 m 9' 9' 61,94 62,3 CH2 3,58 t (6,5) 7',8' 3-OCH3 56,28 56,4 CH3 3,84 s 3
#δC của cedrusin [64] đo trong DMSO-d6, aDMSO-d6, b125MHz, c500MHz
So sánh dữ kiện phổ của LC5 với cedrusin đã công bố [64] cho thấy sự phù hợp về dữ kiện phổ của tại các vị trí tương ứng (bảng 4.1.5), kết hợp với các dữ kiện phổ HSQC và HMBC cho phép khẳng định LC5 là cedrusin (chi tiết phổ xem phụ lục 5).
4.1.6. Hợp chất LC6: Lycernuic B (hợp chất mới)
Hình 4.1.6.a. Cấu trúc của hợp chất LC6 và hợp chất lycernuic A
Hợp chất LC6 thu được ở dạng bột màu trắng, có góc quay cực riêng [ ] -54,3 (c 0,04; MeOH).
Công thức phân tử của LC6 được xác định là C37H56O6, dựa trên phổ HR-ESI- MS, cho pic ion giả phân tử [M-H]- tại m/z 595,4002 (tính toán lý thuyết cho [C37H55O6]-; 595,4004).
50
Hình 4.1.6.b. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất LC6
Phổ 1H-NMR của LC6 cho thấy các tín hiệu proton của 7 nhóm methyl bậc 3 tại
δH 0,76 (CH3-24); 0,86 (CH3-25); 0,88 (CH3-29); 0,94 (CH3-23); 0,97 (CH3-30); 1,04 (CH3-28); và 1,08 (CH3-26); 3 nhóm oxymethine tại H 3,13 (1H; dd; J = 5,0; 11,0 Hz; H-3); 3,38 (1H; br s; H-21) và 4,94 (1H; dd; J = 4,0; 11,0 Hz; H-15). Ngoài ra còn có các tín hiệu của một vòng benzene thế hai tại vị trí 1,4 với δH 8,02 (2H; d; J = 9,0 Hz; H-2′ và H-6′); và 6,86 (2H; d; J = 9,0 Hz; H-3′ và H-5′) gợi ý sự có mặt của nhóm p-hydroxybenzoate.
Hình 4.1.6.c. Phổ 1H-NMR của hợp chất LC6 đo trong DMSO-d6
Phổ 13C-NMR của LC6 cho thấy sự có mặt của 30 nguyên tử carbon, bao gồm 7 nhóm methyl, 10 nhóm methylene, 7 nhóm methine và 6 nguyên tử carbon không
51 chứa proton cùng với các tín hiệu của nhóm p-hydroxybenzoate tại δC 116,2 (C-3′; C-5′); 122,6 (C-1′); 133,1 (C-2′; C-6′); 163,5 (C-4′) và 168,0 (C-7′).
Hình 4.1.6.d. Phổ 13C-NMR của hợp chất LC6 đo trong DMSO-d6
Các dữ kiện này cho thấy LC6 có cấu trúc của một seratane triterpenoid [17]. Khi so sánh với hợp chất lycernuic A [17], các dữ kiện phổ NMR của LC6 tương tự hợp chất này, ngoại trừ việc nhóm -CH2OH trong lycernuic A được thay thế bằng nhóm methyl tại vị trí C-29; và nhóm 3-methoxy-4-hydroxybenzoate tại vị trí C-15 được thay thế bằng nhóm p-hydroxybenzoate trong LC6.
Thật vậy, tín hiệu C-29 tại δC 64,5 của nhóm -CH2OH ở lycernuic A đã chuyển sang vùng trường cao tại δC 28,99, đồng thời trên phổ 1H-NMR và HSQC cho thấy nó gắn với nhóm methyl(δH 0,97) ở dạng một tín hiệu singlet. Điều này khẳng định tại C-29 là nhóm methyl.
Tương tác trên HMBC từ H-15 đến C-7', kết hợp với các dữ kiện phổ HSQC đã