5. Những điểm mới của luận án
1.5. Tính cấp thiết và nội dung nghiên cứu
Gần đây, trong một nghiên cứu về phong cách sống kinh tế xã hội dựa trên bảng câu hỏi về tần suất thực phẩm sử dụng của các đối tượng từ 35–70 tuổi ở 18 quốc gia đã chỉ ra việc tiêu thụ lượng lớn carbohydrate có sẵn trong thực phẩm có thể liên quan đến nguy cơ tử vong cao hơn [199]. Ngày nay, nhận thức và hành vi người tiêu dùng khi sử dụng thực phẩm cũng đang dần thay đổi và chuyển hướng sang sử dụng nhiều hơn các thực phẩm dinh dưỡng có khả năng ngăn ngừa bệnh tật và cải thiện sức khỏe. Điều này thể hiện qua doanh số bán thực phẩm có chức năng tăng cường sức khỏe tăng, đặc biệt là các sản phẩm chứa hàm lượng carbohydrate thấp, chất xơ cao, chất béo thấp, cholesterol thấp và natri thấp [9]. Nghiên cứu thị trường dự báo nhu cầu này sẽ ngày càng tăng lên, cụ thể, thị trường prebiotics toàn cầu sẽ đạt 7,11 tỷ đô la vào năm 2024 (số liệu năm 2016) và nhu cầu về thực phẩm chức năng sinh học có hàm lượng đường huyết thấp bao gồm doanh thu thị trường tinh bột tiêu hóa chậm dự kiến đạt khoảng 12 tỷ đô la vào năm 2025 [8]. Các nghiên cứu về quy trình sản xuất và công bố về lợi ích sức khỏe của các thành phần chức năng này cũng đang nhận được sự quan tâm mạnh mẽ bởi giới khoa học. Theo dữ liệu tài nguyên phân tích bằng sáng chế toàn cầu của Patent Lens, trong giai đoạn 2013-2017, các bằng sáng chế liên quan đến IMO đã tăng 4,3% trong khi dữ liệu FOS (fructooligosaccharides) tăng 4,2% và GOS (galactooligosaccharide) tăng 2,1%. Số liệu này cho thấy tầm quan trọng của các thành phần chức năng và thị trường ứng dụng của chúng đang ngày càng được mở rộng, đi đến gần hơn với người tiêu dùng.
Có thể thấy, IMO và SDS là hai thành phần chức năng mang lại các lợi ích quý báu cho sức khỏe, phù hợp với định hướng phát triển của thị trường và đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng trong xã hội hiện đại. Thêm vào đó, nguồn nguyên liệu chính được sử dụng để sản xuất IMO và SDS trong công nghiệp là tinh bột tự nhiên, đây cũng là một nguồn nguyên liệu dồi dào sẵn có và đang được chú trọng nghiên cứu để tăng cường giá trị thương mại tại Việt Nam. Do đó, việc phát triển quy trình
37
sản xuất IMO và SDS từ tinh bột là đề tài mang tính cấp thiết hướng tới mục tiêu làm chủ quy trình sản xuất trong quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước hiện nay mới chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu và khảo sát trên nhiều đối tượng mà chưa đi đến việc phát triển các sản phẩm sau khi đã biến tính làm gia tăng SDS, RS. Bên cạnh đó, các phương pháp biến tính của các nhóm tác giả chưa có hiệu quả cao trong việc nâng cao hàm lượng SDS. Chính vì vậy, việc ứng dụng SDS trong sản xuất thực phẩm còn nhiều hạn chế và chưa đưa vào các sản phẩm một cách hiệu quả. Thành phần IMO cũng chưa nhận được sự chú ý của các học giả, do đó, chưa có nghiên cứu nào về hoàn thiện quy trình sản xuất IMO từ tinh bột theo phương pháp enzyme tại Việt Nam.
Khoai lang được biết đến là cây lương thực có sản lượng hàng năm lớn và tinh bột khoai lang là nguồn nguyên liệu dồi dào nhưng chưa có nhiều ứng dụng đem lại giá trị cao. Các nghiên cứu tại Việt Nam hướng đến tạo thành phần chức năng trên tinh bột khoai lang cũng chưa được chú trọng. Như vậy, đây là nguồn nguyên liệu mới và có tiềm năng lớn để khai thác sản xuất các thành phần thực phẩm chức năng.
Từ những dữ kiện và phân tích trên, tác giả đi đến quyết định thực hiện đề tài
“Nghiên cứu quá trình thuỷ phân tinh bột khoai lang bằng phương pháp enzyme tạo tinh bột tiêu hoá chậm và isomaltooligosaccharide nhằm ứng dụng trong thực phẩm” với các nội dung:
Nội dung 1: Nghiên cứu đặc tính tinh bột khoai lang và khả năng thu hồi tinh bột của các giống khoai Việt Nam
Nội dung 2: Nghiên cứu điều kiện thu nhận tinh bột tiêu hóa chậm và đặc tính của tinh bột tiêu hóa chậm thành phẩm
2.1. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thủy phân thích hợp tinh bột khoai lang bằng enzyme pullulanase hướng tới sự hình thành SDS
2.2. Nghiên cứu chế độ thoái hóa tinh bột sau thủy phân pullulanase làm tăng hàm lượng SDS
2.3. Đánh giá chất lượng sản phẩm và đưa ra quy trình sản xuất tinh bột tiêu hóa chậm từ tinh bột khoai lang
Nội dung 3: Nghiên cứu điều kiện thu nhận isomaltooligosccharide và đặc tính của isomaltooligosccharide thành phẩm
3.1. Xác định điều kiện thu nhận isomaltooligosaccharide bằng phương pháp phân đoạn
3.2. Xác định điều kiện thu nhận isomaltooligosaccharide bằng phương pháp đường hóa và gắn nhánh đồng thời
Nội dung 4: Khảo sát khả năng ứng dụng tinh bột tiêu hóa chậm và isomaltooligosccharide trong sản xuất thực phẩm
4.1. Ứng dụng bổ sung tinh bột tiêu hóa chậm vào sản phẩm miến dong 4.2. Ứng dụng bổ sung IMO vào sản phẩm sữa tươi và nước quả
38
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu tinh bột khoai lang
Khoai lang củ tươi được thu mua trong ngày thu hoạch, sau đó tiến hành tách và thu nhận tinh bột cùng ngày tại phòng thí nghiệm C4-209, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Đại học Bách Khoa Hà Nội. Nguồn gốc, đặc điểm nhận biết và điều kiện canh tác của sáu mẫu được trình bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Đặc điểm của sáu giống khoai lang nguyên liệu
Giống khoai lang 1 Hoàng Long cũ 2 Hoàng Long mới 3 Nhật Gia Lai 4 Nhật Đà Lạt 5 Nhật ruột trắng 6 Nhật ruột vàng * Số liệu lấy từ QCVN 02:2021/BXD: Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia số liệu điều kiện tự nhiên trong xây dựng
2.1.2. Chế phẩm enzyme
Thông số các chế phẩm enzyme sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.2.
39
Bảng 2.2. Thông số các chế phẩm enzyme sử dụng trong nghiên cứu Chế phẩm enzyme Spezyme Alpha (EC 3.2.1.1) licheniformis Spezyme Xtra (EC 3.2.1.1) licheniformis Liquozyme SC DS licheniformis (EC 3.2.1.1) Termamyl SC DS licheniformis (EC 3.2.1.1) β-Amylase (Barley) (EC 3.2.1.2) Pullulanase M2 (EC 3.2.1.41) licheniformis Transglucosidase (EC 3.2.1.20)
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp công nghệ
2.2.1.1. Phương pháp tách và thu hồi tinh bột
Tinh bột khoai lang được thu nhận dựa trên phương pháp của Talele và cộng sự (2015) với một vài thay đổi [200]. Khoai lang nguyên liệu đem rửa sạch và để ráo. Tiếp đó, khoai được gọt vỏ, thái lát và ngâm trong dung dịch NaHSO3 0,1%. Sau 2 giờ, đổ dung dịch ngâm, tiến hành nghiền thô và nghiền tinh với khoai đã thái lát bằng máy nghiền. Pha loãng hỗn hợp với nước tiến hành rây lần lượt qua: rây No100, rây No200 và rây No400. Dịch tinh bột sau rây được để lắng 6 giờ, sau đó đổ gạn dịch trong và tiếp tục hòa loãng, để lắng. Sau 3 lần, thu được tinh bột ướt, đem sấy ở 35°C trong 10-12 giờ để đạt độ ẩm dưới 12%. Bảo quản tinh bột khoai lang thu được bằng bao kín, đặt ở nơi khô ráo thoáng mát, tránh sự xâm nhập của côn trùng và động vật gây hại.
Tỷ lệ thu hồi tinh bột (tính trên khối lượng củ tươi) được tính theo công thức sau:
Khối lượng tinh bột khô (g)
% Tỷ lệ thu hồi tinh bột =
Khối lượng khoai lang củ tươi (g)x 100%
2.2.1.2. Quy trình sản xuất miến dong
Sản phẩm miến dong có bổ sung tinh bột tiêu hóa chậm được sản xuất trong quy mô phòng thí nghiệm theo quy trình Hình 2.1. Tinh bột dong riềng khối lượng 50g, tinh bột SDS được bổ sung với tỉ lệ lần lượt là 0%, 2,5%, 5%, 7,5% và 10% và hòa trộn với 108 – 118 g nước. Hỗn hợp được trộn đều và đưa lên máy tráng tại phòng thí nghiệm để tạo lớp mỏng và tạo điều kiện cho quá trình hồ hóa. Tiến hành làm khô sơ bộ trong khoảng 1 giờ 30 phút và cắt thành sợi nhỏ. Sau đó, đem sản phẩm đi sấy kết thúc ở 40oC trong vòng 4 giờ. Miến thành phẩm thu được đem bao gói và bảo quản ở điều kiện khô ráo, thoáng mát để tiến hành các phân tích tiếp theo.
41
Hình 2.1: Quy trình sản xuất miến dong
2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.2.2.1. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu tính chất, cấu trúc và lựa chọn giống khoai lang
Tinh bột thu nhận từ 6 giống khoai lang trồng phổ biến tại Việt Nam được tiến hành phân tích tính chất và cấu trúc bao gồm: xác định hàm lượng tinh bột, khả năng thu hồi tinh bột; quan sát đặc điểm hình thái hạt tinh bột (hình ảnh chụp SEM và phân tích kích thước hạt); đặc tính cấu trúc hạt tinh bột (độ dài trung bình mạch tinh bột) và xác định tính chất lý hóa của các loại tinh bột (độ nhớt, độ hút nước, khả năng hòa tan, mức độ thoái hóa gel). Dựa vào kết quả các phân tích trên, lựa chọn được giống khoai đem lại khả năng thủy phân hiệu quả nhất để sản xuất IMO và SDS. Giống khoai được chọn là nguyên liệu sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
42
2.2.2.2. Bố trí thí nghiệm thu hồi SDS từ tinh bột khoai lang.
Hình 2.2: Bố trí thí nghiệm thu hồi SDS từ tinh bột khoai lang
(1) Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân tinh bột khoai lang bằng enzyme pullulanase hướng tới sự hình thành SDS
(i) Ảnh hưởng của nồng độ tinh bột tới khả năng tiêu hóa của tinh bột khi thủy phân bởi pullulanase
Dịch tinh bột với các nồng độ 5; 7,5; 10; 12,5 và 15% (w/v, tính theo chất khô) pha trong đệm acetate 0,2M pH 5,0. Đun cách thủy 30 phút để hỗn hợp được hồ hóa hoàn toàn, sau đó làm mát nhanh dưới vòi nước để đưa về nhiệt độ 55°C, bổ sung enzyme pullulanase nồng độ 30 U/g và duy trì trong thời gian 4 giờ. Kết thúc phản ứng bằng cách đun sôi hỗn hợp trong 30 phút. Tiến hành xác định khả năng tiêu hóa của hỗn hợp thu được. Lựa chọn được nồng độ tinh bột CP % đem lại hiệu quả nhất trong việc tạo SDS.
(ii) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme pullulanase tới khả năng tiêu hóa của tinh bột
43
Giữ nguyên các thông số điêu kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nồng độ tinh bột được lựa chọn và nồng độ enzyme pullulanase bổ sung lần lượt là 10; 20; 30; 40; 50 U/g. Nồng độ enzyme Pp U/g cho hiệu suất SDS cao nhất được lựa chọn sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
(iii) Ảnh hưởng của pH tới khả năng tiêu hóa của tinh bột khi thủy phân bởi pullulanase
Giữ nguyên các thông số điêu kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nồng độ enzyme pullulanase được lựa chọn và pH lần lượt là 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0. Thu được sản phẩm thủy phân và tiến hành xác định khả năng tiêu hóa. Lựa chọn được điêu kiện pHp cho hàm lượng SDS lớn nhất.
(iv) Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng tiêu hóa của tinh bột khi thủy phân bởi pullulanase
Giữ nguyên các thông số điêu kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi pH được lựa chọn và nhiệt độ lần lượt là 45; 50; 55; 60; 65 oC. Thu được sản phẩm thủy phân và tiến hành xác định khả năng tiêu hóa. Dựa trên hàm lượng SDS, lựa chọn được Tp °C là điêu kiện tốt nhất cho quá trình thủy phân.
(v) Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới khả năng tiêu hóa của tinh bột Giữ nguyên các thông số điêu kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nhiệt độ được lựa chọn và lấy mẫu tại các thời điểm từ 1 đến 8 giờ (sau mỗi 1 giờ). Tiến hành xác định khả năng tiêu hóa của sản phẩm thủy phân thu được. Lựa chọn được thời gian tp giờ là thời điểm cho hàm lượng SDS cao nhất mà vẫn đảm bảo tiết
kiệm năng lượng.
(2) Nghiên cứu chế độ thoái hóa tinh bột sau thủy phân pullulanase làm tăng hàm lượng SDS
Chế độ thoái hóa tinh bột sau thủy phân pullulanase để gia tăng hàm lượng SDS được nghiên cứu qua 3 lần thoái hóa.
(i) Ảnh hưởng của nhiệt độ thoái hóa lần 1 đến khả năng hình thành tinh bột tiêu hóa chậm
Gel thu được sau quá trình thủy phân được bảo quản ở các nhiệt độ
-20℃, - 10℃, 4℃ và 25℃ trong thời gian 48 giờ để quá trình thoái hóa được diễn ra. Thông số khảo sát được lựa chọn liên quan đến nhiệt độ
bảo quản thực phẩm trên thực tế. Khi hoàn thành, đem hỗn hợp ly tâm với tốc độ 3660 rpm trong vòng 10 phút, đổ bỏ dịch trong, sau đó bổ sung nước cất để rửa phần cặn thu được, lặp lại 2 lần. Kết tủa cuối cùng đem sấy ở 40oC trong khoảng 24 giờ để độ ẩm đạt nhỏ hơn 10% và đem nghiên nhỏ, rây qua rây No120. Tiến hành xác định khả năng tiêu hóa của các mẫu bột thu được. Nhiệt độ thoái hóa TTH1 ℃ được lựa chọn tạo điêu kiện tốt nhất cho sự hình thành SDS.
(ii) Ảnh hưởng của thời gian thoái hóa lần 1 đến hàm lượng tinh bột tiêu hóa chậm
Thí nghiệm được tiến hành tương tự ở TTH1℃ trong thời gian từ 12 giờ đến 60 giờ và lấy mẫu sau mỗi 12 giờ để xác định khả năng tiêu hóa của sản phẩm. Thời gian tTH1 giờ được lựa chọn để thực hiện thoái hóa khi tạo hàm lượng SDS lớn nhất.
44
Sau thoái hóa lần 1, các mẫu được đem đi đun sôi trong 30 phút và tiến hành khảo sát ảnh hưởng của lần thoái hóa thứ hai và thứ ba đến sự hình thành SDS. Từ đó, kết luận được ảnh hưởng của công đoạn thoái hóa đến sự hình thành SDS cùng với điều kiện về nhiệt độ và thời gian thực hiện thoái hóa tương ứng.
2.2.2.3. Bố trí thí nghiệm thu hồi IMO từ tinh bột khoai lang bằng phương pháp phân đoạn
Hình 2.3: Bố trí thí nghiệm thu hồi IMO từ tinh bột khoai lang bằng phương pháp phân đoạn
(1) Ảnh hưởng của mức độ thủy phân đến hiệu quả tổng hợp IMO
Để đánh giá ảnh hưởng của quá trình thủy phân tinh bột trước khi đưa dịch vào giai đoạn gắn nhánh đến khả năng tổng hợp IMO, tiến hành tạo các dịch thủy phân có mức độ thủy phân (DE) khác nhau và thực hiện gắn nhánh các dung dịch đã chuẩn bị. Dịch tinh bột 25% (w/v) được thủy phân bằng α- amylase (1,0 CU/g) và β-amylase (8 U/g) trong các khoảng thời gian khác nhau. Dịch sau thủy phân sau đó được đem gắn nhánh bằng enzyme transglucosidase nồng độ 15 U/g trong điều kiện nhiệt độ 50°C, pH 5,0 trong thời gian 12 giờ. Tiếp theo, loại bỏ đường đơn giản trong dịch sản phẩm bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus BE 134.
45
Thành phần IMO trong dịch sản phẩm được phân tích bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI và tính toán hàm lượng IMO234 là tổng của hàm lượng IMO2, IMO3 và IMO4. Từ đó, đánh giá được điều kiện cần thiết về mức độ thủy phân tinh bột khoai lang trước khi đưa vào tổng hợp IMO sử dụng enzyme transglucosidase.
(2) Lựa chọn chế phẩm Alpha amylase phù hợp cho quá trình dịch hóa
Lựa chọn chế phẩm alpha amylase phù hợp cho quá trình dịch hóa dựa trên xác định thành phần oligosaccharide được tạo thành sau thủy phân bởi các chế phẩm Spezyme Xtra, Liquozyme SC DS, Spezyme Alpha, Termamyl SC DS. Các thí nghiệm được tiến hành ở cùng nồng độ cơ chất là 25% (tính theo khối lượng tinh bột khô), pH 5,8 (đệm acetate 0,2M), nhiệt độ phản ứng là 80°C (Spezyme Xtra và Liquozyme SC DS), 85°C (Spezyme Alpha và Termamyl SC DS) thời gian phản ứng 30 phút, nồng độ enzyme alpha amylase 1 CU/g. Lặp lại thí nghiệm 2 lần.
Hỗn hợp thu được sau dịch hóa đem xử lý, xác định thành phần oligosaccharide bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - RI và hàm lượng tinh bột sót bằng phương pháp xác định carbohydrate tổng số. Từ đó chọn được chế phẩm enzyme phù hợp nhất với hàm mục tiêu: Hàm lượng DP 1-10 (% w/w), DP 2-6 (% w/w) lớn nhất; tinh bột sót thấp.