CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Phương pháp phân tích
2.2.3.1. Phương pháp hóa sinh
(1) Xác định hàm lượng tinh bột bằng phương pháp DNS
Hàm lượng tinh bột trong mẫu bột khoai lang được định lượng dựa trên nguyên tắc thủy phân tinh bột thành đường bằng dung dịch HCl 2% và xác định hàm lượng đường trong dịch thu được [201]. Cân khoảng 2g bột khoai vào bình tam giác dung tích 250 ml. Tiếp theo thêm 100 ml HCl 2%, đậy nút cao su và nối với ống sinh hàn khí. Lắc nhẹ rồi đặt vào nồi đun cách thuỷ, đun tới sôi và duy trì trong 2 giờ. Sau khi hoàn thành, toàn bộ lượng tinh bột đã chuyển hóa thành glucose, làm nguội đến nhiệt độ phòng rồi trung hoà hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 10% với chỉ thị phenolphtalein. Sau khi trung hòa, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 250 ml, tráng bình rồi thêm nước cất đến vạch định mức và đem lọc. Xác định hàm lượng đường khử trong dịch thu được bằng phương pháp so màu sử dụng thuốc thử DNS. Lấy 0,4 ml dịch đường và thêm vào 0,8 ml DNS 1%, đun sôi hỗn hợp trong 15 phút. Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm.
(2) Xác định hàm lượng amylose theo TCVN 5716-1: 2008
Phương pháp xác định hàm lượng amylose được tiến hành dựa trên TCVN 5716-1: 2008. Cân chính xác 0,1 g mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml cồn etylic 95% và 9 ml NaOH 1N và đun cách thủy trong 10 phút. Làm nguội ống nghiệm đến nhiệt độ phòng và để yên trong 2 giờ. Định mức hỗn hợp thu được lên 100 ml bằng nước cất. Lấy chính xác 5 ml dung dịch vừa định mức cho vào bình định mức 100ml chứa sẵn 50 ml nước cất. Bổ sung thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,09 N và 1 ml CH3COOH 1N, thêm tiếp 2ml dung dịch I2 0,2%. Định mức hỗn hợp lên 100 ml bằng nước cất, để yên hỗn hợp trong 20 phút rồi tiến hành đo OD ở bước sóng 620 nm.
51
Pha các dung dịch hỗn hợp AM và AP với tỷ lệ dung dịch AM và AP lần lượt: 0%, 10%, 20%, 30%, 35% và tiến hành tương tự như với mẫu thí nghiệm đã nêu. Đo OD các hỗn hợp AM và AP ở bước sóng 620 nm và thiết lập đường chuẩn tỷ lệ amylose và amylopectin (% v/ v) và mật độ quang.
(3) Xác định hàm lượng carbohydrate tổng số bằng phương pháp phenol – axit sulfuric
Xác định hàm lượng carbohydrate tổng số dựa trên phương pháp của Dubois và cộng sự (1956) [202]. Cân chính xác 10 mg mẫu, thêm 0,2 ml etanol 80 độ và 1 ml DMSO 90%. Lắc đều ống nghiệm và để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng. Thêm 2 ml nước cất và đun sôi hỗn hợp trong 15 phút. Tiếp đó, làm nguội và thêm nước cất đến 10 ml. Pha loãng dung dịch thu được đến nồng độ phù hợp để tiếp tục tiến hành thí nghiệm (dung dịch B). Lấy 1ml dung dịch B vào ống nghiệm thủy tinh, thêm 1 ml phenol 5% và 5 ml H2SO4 đậm đặc, đợi 20 phút phản ứng và đo độ hấp phụ quang ở bước sóng 490 nm. Đường chuẩn xác định hàm lượng carbohydrate tổng số được dựng bằng dung dịch chuẩn glucose có nồng độ từ 20 µg/ml đến 100 µg/ml.
(4) Xác định hàm lượng tinh bột sót bằng phương pháp phenol – axit sulfuric
Sau khi xử lý với enzyme α-amylase, dịch thủy phân được ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/ phút trong thời gian 15 phút để thu tinh bột sót. Đổ phần dịch nổi và thêm nước cất để rửa cặn thu được, lặp lại 3 lần. Cặn thu được chính là thành phần không bị thủy phân bởi enzyme và đem xác định hàm lượng bằng phương pháp phenol – axit sulfuric như đã trình bày ở mục 2.2.3.1c. Kết quả lượng tinh bột sót được tính toán bằng tỷ lệ phần trăm giữa hàm lượng tinh bột sót và hàm lượng cacbohydrate tổng số trong dung dịch. Trong đó, hàm lượng cacbohydrate tổng số được xem như tương đương với hàm lượng tinh bột do các thành phần phụ khác trong mẫu tinh bột đem thủy phân là không đáng kể (Phụ lục E).
(5) Xác định chiều dài mạch của phân tử tinh bột
Số đơn phân trung bình của phân tử tinh bột được xác định bằng: DP = TC/ RR. Trong đó: TC là hàm lượng carbonhydrate tổng số (mục 2.2.2.3) và RR là hàm lượng gốc khử.
Hàm lượng gốc khử được xác định theo phương pháp của Susumu Hizukuri và cộng sự (1981) [203]. Chuẩn bị ba dung dịch thuốc thử: dung dịch A (hòa tan 1g K3Fe(CN)6 trong 1 lít nước cất, điều chỉnh tới pH = 9,5 bằng KOH 1N), dung dịch B (hòa tan 4,8g Na2CO3, 9,2g NaHCO3 và 0,65g KCN trong 1 lít nước cất); dung dịch C (3g FeNH4(SO4)2.12H2O và 2,72 ml H2SO4 đặc, định mức 1 lít bằng nước cất).
Cân chính xác 10 mg mẫu tinh bột, thêm 0,2 ml ethanol 80 độ và 1 ml DMSO 90%, lắc đều và để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng. Thêm 2ml nước cất, đun sôi trong 15 phút, sau đó làm lạnh, thêm nước cất cho đủ 10 ml thu được dung dịch E. Lấy 1 ml dung dịch E, thêm 0,5 ml dung dịch A và 0,5 ml dung dịch B. Đun sôi cách thủy 15 phút. Làm nguội và thêm 2,5 ml dung dịch C thu được dung dịch có màu xanh. Đợi phản ứng 20 phút và đo mật độ quang ở bước sóng 715 nm. Đường chuẩn xác
52
định hàm lượng gốc khử được thiết lập bằng dung dịch chuẩn glucose nồng độ 2 - 10 µg/ml.
(6) Xác định mức độ thủy phân của tinh bột
Đương lượng dextrose DE (dextrose equivalent) biểu thị sự gia tăng của hàm lượng đường khử trong dịch thủy phân và thể hiện cho mức độ thủy phân của dịch. Dịch có mức độ thủy phân cao sẽ tạo ra càng nhiều gốc khử, DE càng lớn. Giá trị DE được tính toán dựa trên công thức [204], [205]:
DE =Hàm lượng đường khử (biểu thị bằng số gam D−Glucose) x 100Hàm lượng carbohydrate tổng số
Trong đó, hàm lượng đường khử được xác định theo phương pháp S. Hizukuri và cộng sự (1981) [203] (đã trình bày tại mục 2.2.2.5) với glucose được sử dụng làm chất chuẩn; hàm lượng carbohydrate tổng số được xác định bằng phương pháp phenol-sulfuric theo Dubois và cộng sự (1956) [202].
(7) Xác định mức độ tiêu hóa của tinh bột bằng phương pháp Englyst
Các chế phẩm enyme sử dụng trong xác định mức độ tiêu hóa của tinh bột: α-amylase porcine pancreas (EC 3.2.1.1) (≥ 5U/mg) hãng Sigma-Aldrich; amyloglucosidase (EC 3.2.1.3) (3260 U/ml) và invertase (EC 3.2.1.26) (2000 U/ml) mua từ hãng Megazyme; Bộ kit phân tích D-Glucose (GOPOD Format) của hãng Megazyme.
Mức độ tiêu hóa của tinh bột và các mẫu thí nghiệm được xác định dựa trên phương pháp của Englyst (1992) và Miao, Xiong và cộng sự (2014) [88], [103]. Trước tiên, cần chuẩn bị 3 dung dịch enzyme:
• Dung dịch enzyme I: 0,14 ml enzyme amyloglucosidase được pha loãng thành 6,0 ml với nước khử ion.
• Dung dịch enzyme II: cân 12g enzyme pancreatic α- amylase hòa trong 80ml nước, khuấy từ trong 10 phút, sau đó ly tâm hỗn hợp 10 phút ở 1500 g. Sau ly tâm, thu được 54ml dịch trong.
• Dung dịch enzyme III: được chuẩn bị ngay trước khi tiến hành thí nghiệm bằng cách trộn 4 ml nước cất, 6 ml dung dịch enzyme I và 54ml dung dịch enzyme II. Cân 200 mg mẫu tinh bột và phân tán trong 15ml đệm phosphate 0,2M pH 5,2. Dịch tinh bột sau đó được ổn định nhiệt trong 5 phút tại 37oC. Thêm 5ml dung dịch enzyme III, để trong tủ lắc tại 37 oC, 150 rpm. Sau 20 và 120 phút, lấy mỗi mẫu 0,5 ml và thêm vào 4ml cồn tuyệt đối để ngưng hoạt động của enzyme. Hàm lượng glucose tạo thành được xác định bằng bộ kit GOPOD. Phần trăm thủy phân tinh bột được tính thep nồng độ glucose tạo thành nhân với 0,9. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Kết quả hàm lượng tinh bột tiêu hóa nhanh (RDS), tinh bột tiêu hóa chậm (SDS) và tinh bột kháng tiêu hóa (RS) được tính toán như sau:
% RDS = (G20 – FG) × 0,9 x 100
% SDS = (G120 – G20) × 0,9 x 100
53
% RS = (TG - FG) × 0,9 × 100 - %RDS - %SDS
Trong đó: TG: Tổng hàm lượng glucose; G20: Tổng hàm lượng glucose sau 20 phút tiêu hóa; G120: Tổng hàm lượng glucose sau 120 phút tiêu hóa; FG: Glucose tự do.
(8) Xác định hoạt độ enzyme α-amylase bằng phương pháp Ceralpha
Hoạt độ chế phẩm enzyme α- amylase được xác định bằng phương pháp Ceralpha theo kit của hãng Megazyme với nguyên tắc được trình bày ở Hình 2.5.
Hình 2.5: Cơ sở lý thuyết phương pháp Ceralpha xác định hoạt độ enzyme α-amylase
[206]
Quy trình xác định hoạt độ các chế phẩm enzyme α-amylase được tiến hành như sau. Lấy 0,2 ml dung dịch cơ chất BPNPG7 vào ống nghiệm và ổn nhiệt ở 40 °C trong 5 phút. Đồng thời, dịch enzyme đã pha loãng được ổn nhiệt ở 40 °C trong 5 phút. Thêm 0,2 ml dịch enzyme pha loãng vừa trên vào ống nghiệm chứa cơ chất. Ổn nhiệt ở 40°C trong 10 phút. Sau 10 phút, thêm chính xác 3ml dung dịch dừng phản ứng tri-sodium phosphate và lắc đều. Đo độ hấp phụ quang của dung dịch và mẫu kiểm chứng được đo tại bước sóng 400 nm. Một đơn vị hoạt độ enzyme α- amylase được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng một micromole p- nitrophenol từ BPNPG7 trong một phút tại 40 °C, được gọi là đơn vị Ceralpha (CU).
(9) Xác định hoạt độ enzyme β – amylase bằng kit Betamyl-3
54
Hình 2.6: Cơ sở lý thuyết của phương pháp Betamyl-3 xác định hoạt độ enzyme β-amylase
[207]
Hoạt độ enzyme β – amylase được xác định bằng phương pháp Betamyl-3 theo kit của hãng Megazyme với nguyên tắc được trình bày ở Hình 2.6.
Tiến hành xác định hoạt độ enzyme β-amylase theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Lấy 0,2 ml dịch enzyme đã pha loãng tới nồng độ phù hợp vào ống nghiệm, ổn nhiệt ở 40 oC trong 5 phút. Đồng thời, cơ chất PNPβ-G3 cũng được ổn nhiệt ở 40 °C trong 5 phút. Thêm 0,2 ml dung dịch cơ chất vào ống nghiệm chứa enzyme, lắc đều và ổn nhiệt ở 40 °C trong 10 phút. Sau 10 phút, thêm 3ml đệm tris để dừng phản ứng và hình thành màu vàng của phenolate. Đo độ hấp phụ của dung dịch và mẫu kiểm chứng tại bước sóng 400nm đã trừ nước cất.
Một đơn vị hoạt độ enzyme được định nghĩa là lượng enzyme β-amylase cần thiết để giải phóng một micromole p-nitrophenol từ PNPβ-G3 trong một phút dưới các điều kiện thí nghiệm nêu trên, và được gọi là đơn vị Betamyl-3 (U).
(10) Xác định hoạt độ enzyme pullulanase sử dụng Red-Pullulan
Quy trình xác định hoạt độ enzyme pullulanase được tiến hành theo hướng dẫn của Megazyme [208]. Khi ủ cơ chất Red-Pullulan (được mua từ Megazyme) với pullulanase, cơ chất bị phân cắt nội mạch (endo) tạo thành các phân tử màu trọng lượng thấp và vẫn có mặt trong dung dịch khi thêm ethanol vào hỗn hợp phản ứng. Phần phân tử có khối lượng phân tử cao được ly tâm để loại bỏ và đo màu phần dịch nổi tại bước sóng 510 nm.
Ổn nhiệt dịch enzyme ở 40 °C trong 5 phút. Thêm 1,0 ml dung dịch enzyme đã ổn nhiệt vào 0,5 ml dung dịch cơ chất Red Pullulan. Lắc đều hỗn hợp và ủ ở 40 °C trong 10 phút. Kết thúc phản ứng và kết tủa cơ chất cao phân tử bằng cách thêm 2,5 ml ethanol (95% v/ v), lắc mạnh bằng máy lắc ống nghiệm trong 10 giây. Đợi phản ứng diễn ra tại nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm ở 1000 g trong 10 phút. Thu dịch trong và độ hấp phụ quang ở bước sóng 510 nm.
Hoạt độ được xác định bằng cách tham chiếu đến đường cong chuẩn. Mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách thêm ethanol vào cơ chất Red-Pullulan trước khi thêm enzyme. Một đơn vị hoạt động (U) được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để
55
giải phóng một μmole đương lượng đường khử D-glucose mỗi phút trong các điều kiện thí nghiệm xác định (pH 5,0, 40 ° C).
(11) Xác định hoạt độ enzyme transglucosidase sử dụng maltose
Xác định hoạt tính transglucosidase với chất là cơ maltose [147]. Enzyme được ủ ở 40 °C với dung dịch maltose 1% (w/w) trong dung dịch đệm natri acetate 0,5 mM (pH 4,0) trong 15 phút. Dừng phản ứng bằng cách đun hỗn hợp phản ứng với nước sôi trong 10 phút và lượng glucose giải phóng được đo bằng bộ kit GOD-POD của hãng Megazyme. Một đơn vị hoạt động của enzyme được định nghĩa là số lượng enzyme tạo ra 1 mol glucose mỗi phút trong điều kiện nêu trên (U).
(12) Định tính thành phần hỗn hợp đường bằng sắc kí bản mỏng (TLC)
Định tính thành phần hỗn hợp IMO bằng sắc ký bản mỏng (TLC) được nhiều tác giả sử dụng trong các nghiên cứu [146], [152], [209]. Các thử nghiệm được tiến hành để chọn ra hệ dung môi phù hợp nhất cho phân tích thành phần oligosaccharide trong hỗn hợp IMO thu được. Hệ dung môi từ nghiên cứu của S. Chiba và T. Shimomura (1965) được chọn trong nghiên cứu này [210].
Mẫu phản ứng (1 µl) và các mẫu chuẩn glucose, maltose, maltotriose, Isomaltose (IMO2), Isomaltotriose (IMO3) được chấm lên bản sắc ký mỏng TLC Silica gel 60 F254 (20 cm × 20 cm; Merck KGaA, Germany), cách khoảng 10 mm từ dưới lên. Các mẫu được chấm cách nhau 10 mm. Sấy khô các vết chấm giữa mỗi lần chấm để giữ kích thước của chúng trong khoảng từ 3 đến 4 mm. Tiếp đó, bản sắc ký được nhúng vào hỗn hợp dung môi bao gồm n-butanol: isopropanol: nước (50: 25: 20 v/ v/ v) trong bình sắc ký. Dung môi và chất cần phân tích di chuyển hướng lên trên bởi lực mao quản. Lực tương tác giữa dung môi – thành phần các chất phân tích- bản mỏng khác nhau là nguyên lý để phân tách thành phần các chất cần phân tích.
Kết thúc quá trình trên, bản sắc ký được làm khô trong không khí. Để quan sát các thành phần sau phân tích, nhúng bản mỏng vào dung dịch ethanol có chứa 5g/ l α-naphthol và 50 ml/l H2SO4. Lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí và sấy bằng không khí nóng ở 120 oC trong 10 phút.
(13) Phương pháp loại bỏ đường glucose, maltose, maltotriose trong hỗn hợp IMO sản phẩm bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae
Hỗn hợp IMO sản phẩm chứa các thành phần đường không mong muốn như glucose, maltose, maltotriose. Chủng nấm men lên men bia Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus BE 134 (hãng Fermentis) được sử dụng để loại bỏ các đường này.
Nấm men được hòa tan trong nước cất, hoạt hóa ở 28°C trong 15 phút. Thêm vào hỗn hợp IMO sao cho mật độ tế bào S. cerevisiae trong mẫu đạt 2,0 ×108 tế bào/ ml [153]. Hỗn hợp được ổn nhiệt ở 28 °C. Lấy 1 ml mẫu sau mỗi 12 giờ và gia nhiệt đến 95 °C trong 10 phút để diệt nấm men. Ly tâm mẫu ở 10000 ×g trong 15 phút để loại bỏ tế bào nấm men, thu phần dịch trong và tiến hành định tính thành phần đường trong hỗn hợp sau phản ứng bằng sắc ký bản mỏng TLC. Khi không
56
còn quan sát thấy sự có mặt của glucose, maltose và maltriose (khoảng 6 ngày) thì quá trình lên men kết thúc, diệt men bằng cách đun mẫu ở 95 °C trong 10 phút. (14) Xác định hàm lượng thành phần oligosaccharides bằng máy sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC)
Mẫu sau khi đã loại bỏ glucose, maltose, maltotriose bằng nấm men
Saccharomyces cerevisiae (2.2.2.13) được đem ly tâm ở 10000 ×g trong 15 phút. Tiếp tục lọc dịch thu được qua màng lọc 0,22 µm và định lượng thành phần IMO bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - RI. Dựa trên sự tương tác khác nhau giữa chất phân tích và pha động, chất phân tích và pha tĩnh, giữa pha động và pha tĩnh mà thời gian lưu của các chất trong pha tĩnh là khác nhau, từ đó, đầu dò sẽ phát hiện, thông tin phân tích được thể hiện trên giản đồ sắc ký.
Hệ thống sắc ký lỏng cao áp RID (HPLC 1290 - Agilent) được sử dụng sử dụng trong toàn bộ nghiên cứu này. Hệ gồm cột phân tích HyperRez XP, Carbohydrate Na+, (7.7 x 300 mm) với cột bảo vệ tương ứng với HyperRez XP, Carbohydrate Na+, (7.7x50mm) của Thermo Scientific. Chất chuẩn oligosaccharide tuyến tính bao gồm glucose, maltose, maltotriose (G3), maltotetraose (G4), maltopentaose (G5), maltohexaose (G6), maltoheptaose (G7), maltooctaose (G8), maltononaose
(G9), maltodecaose (G10), isomaltose (IMO2), isomaltotriose (IMO3), isomaltotetraose (IMO4). Pha động là H2O (100%) với tốc độ dòng 0,05 ml/ phút, thể tích tiêm mẫu là 20 µl.
Hàm lượng IMO trong dịch IMO sản phẩm được tính bằng tổng hàm lượng IMO2, IMO3, IMO4 và kí hiệu là IMO234 (g/l).
2.2.3.2. Phương pháp hóa lý và vật lý
(1) Xác định hình dạng hạt tinh bột bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Hạt tinh bột các giống khoai lang được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét theo quy trình của Hung & Morita (2005) [211]. Phân tán tinh bột trong dung dịch ethanol 95% trong vài phút và rắc lên băng dính hai mặt gắn trên thân nhôm, phủ Pt. Tiến hành chụp bằng thiết bị SEM (JSM-IT200, Tokyo, Nhật Bản) ở hiệu điện thế gia tốc 5 kV.
(2) Xác định kích thước hạt tinh bột bằng tán xạ laser