Đây là nội dung đặc trưng nhưng cũng là phức tập nhất của quy hoạch cực trị. Căn cứ vào hàm toán đã lập được, ta có thể dùng các phương pháp tối ưu tác động lên nó để tìm ra các chế độ tối ưu. Các phương pháp tối ưu có thể là: phương pháp giải tích, phương pháp quy hoạch, dùng các phần mềm như: Modde 5.0, ANN, Inform 3.0, Stargraphic 7.0 ... [32, 33, 47]
1.5.6. Kiểm chứng bằng thực nghiệm
Để khẳng định tính đúng đắn và độ tin cậy của các kết quả nghiên cứu trên, người thực nghiệm cần đặt thực nghiệm vào điểm tối ưu và kiểm định sự phù hợp của giá trị tối ưu xác định bởi phương trình hồi quy so với kết quả thực nghiệm. Để kết quả kiểm chứng là tin cậy về mặt thống kê cần đánh giá theo các chuẩn thống kê (chuẩn Fisher, Student…). [5, 6, 7, 8, 9, 20]
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu, tá dược
STT Hoá chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Triamcinolon acetonid Trung Quốc USP 27
2 Macrogol 4000 Trung Quốc BP 2001
3 Benzyl alcohol Trung Quốc Bp 2001
4 Alcol ethylic Trung Quốc Bp 2001
5 Povidone Trung Quốc Bp 2001
6 Polyoxyethylen stearat Trung Quốc BP 2001 7 Carboxymethylcellulose
Sodium Trung Quốc JP 14 & BP 98
8 Sodium dihydrogen
phosphate dihydrate Trung Quốc USP 26 9 Dibasic sodium
phospate dodecahydrate Trung Quốc BP 2001
10 Citric acid Trung Quốc Bp 2001
11 Sodium citrate Trung Quốc Bp 2001
12 Tween 80 Trung Quốc NF 18
13 Span 80 Trung Quốc NF 18
14 Nước cất pha tiêm Việt Nam DĐVN 3
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
- Nhớt kế mao quản tự động Prolabo.
- Máy đo điện thế zeta Zeta Phoremeter IV – CAD.
- Máy đo phõn bố kích thước tiểu phõn HORIBA Laser scattering particle size distribution analyzer LA- 950.
- Máy HPLC Spectra System, Detector UV-VIS 6000LP. - Máy khuấy từ gia nhiệt Hettich.
- Máy đo pH Eutech Instruments pH 510. - Tủ sấy tĩnh, tủ ấm,tủ vi khí hậu Climacell. - Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H.
- Nồi cách thuỷ, cân kỹ thuật, cân phân tích, thước đo và các dụng cụ, thiết bị bào chế, kiểm nghiệm khác.
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
- Bộ môn Vật lý – Hoá lý, Trường Đại học Dược Hà Nội. - Phòng thí nghiệm trung tõm, Trường học Dược Hà Nội. - Bộ môn Hoá lý, Trường Đại học khoa học tự nhiên. - Bộ môn Hoá dầu, Trường Đại học Bách Khoa.
2.1.4. Thời gian nghiên cứu
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Khảo sát để đánh giá các phương pháp xác định một số chỉ tiêu vật lý, hóa lý của một số hỗn dịch tiêm chứa hoạt chất Triamcinolon acetonid cú trờn thị trường.
- Xác định phõn bố KTTP. - Xác định độ nhớt.
- Xác định thế zeta. - Xác định R sa lắng.
2.2.3. Xây dựng công thức và quy trình bào chế hỗn dịch tiêm Triamcinolon acetonid
- Xác định chỉ số HLB tối ưu. - Xác định pH tối ưu.
- Xác định các thành phần trong công thức hỗn dịch. - Tối ưu hóa công thức bào chế hỗn dịch.
2.2.4. Xõy dựng dự thảo tiêu chuẩn chất lượng và quy trình bào chế thuốc tiêm hỗn dịch triamcinolon acetonid.
2.2.5. Theo dõi độ ổn định của thuốc hỗn dịch Triamcinolon acetonid bào chế theo công thức và quy trình tìm được.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp xác định thế điện động zeta.
Nguyên tắc: Thế zeta thường được xác định bằng phương pháp điện di trên thiết bị bao gồm kớnh hiển vi để theo dừi quóng đường di chuyển của tiểu phõn tích điện trong điện trường giữa hai điện cực platin. Thời gian được tự động hóa gắn trong thiết bị đo. [13, 18, 30, 43]
Thế zeta được tính theo công thức (2.3.1.1)
trường; E là cường độ điện trường; ε là hằng số điện môi; η là độ nhớt của môi trường. Thực nghiệm được đo ở dụng cụ đo được mô tả tại hình 2.3.1.
Hình 2.3.1. Thiết bị đo thếZeta Phoremeter IV - CAD
a.Thông số kỹ thuật chủ yếu (Specifications) -Thế Zeta Thế Zeta : -150 ữ +150 mV
-Độ dẫn Độ dẫn điện của dịch đo: 1.00 μS/cm ữ 100.00 mS/cm -pH : 2 ữ 11 pH : 2 ÷ 11
-Nhiệt độ : Nhiệt độ phòng đến 40°C Nhiệt độ : Nhiệt độ phòng đến 40°C
-Điện thế cell đo : 0 ữ 255 V Điện thế cell đo : 0 ÷ 255 V
-Cường độ dòng cell đo: 0 ữ 9,99 mA Cường độ dòng cell đo: 0 ÷ 9,99 mA
-Kính hiển vi laser (kớnh siờu vi) kết nối máy tính và phần mềm xử lý Kính hiển vi laser (kính siêu vi) kết nối máy tính và phần
mềm xử lý b. Nguyên lý hoạt động
Thế Zeta của các hệ phân tán trong dung dịch đo trên thiết bị Zeta Phoremeter IV (CAD Instrumentation) dựa trên nguyên lý của hiện tượng điện di. Các hạt của hệ được phân tán trong dung dịch ở nồng độ thích hợp nhờ thiết bị phân tán bằng siêu âm trước khi đưa vào hệ đo. Giá trị thế Zeta được đo tính theo công thức Smoluchowski’s :
(2.3.1.2) Trong đó :
- ζ là thế Zeta (mV) - η là độ nhớt môi trường - ε là hằng số điện môi
- : độ di chuyển của hạt trong điện trường + v là tốc độ chuyển động của hạt (cm/giõy)
+ E là điện thế áp vào hệ đo (V)
+ L là khoảng cách giữa hai điện cực (cm)
Tốc độ chuyển động của hạt (v) trong điện trường được xác định nhờ thiết bị kớnh siờu vi được kết hợp cùng hệ đo.
c. Điều kiện đo:
- Nhiệt độ: 27 oC
- Độ dẫn điện của dịch đo: 0.018 mS/cm - pH: 6 – 7
2.3.2. Phương pháp định lượng Triamcinolone acetonid
a. Thuốc thử:
Acetonitril (loại dùng cho sắc ký lỏng) Methanol (loại dùng cho sắc ký lỏng)
b. Điều kiện sắc ký:
Cột Lichrosorb RP 18 (250 x 4 mm: 5 μm) Detector UV: 245 nm
Tốc độ dòng: 1 – 1,5 ml/phỳt Thể tích tiêm: 20 μl
Pha động: dung dịch actonitril 30% v/v trong nước.
c. Tiến hành: Dung dịch chuẩn nội: hòa tan fluoxymesterone vào trong methanol để được dung dịch có nồng độ khoảng 84 μg/ ml.
Dung dịch chuẩn: Hòa tan chính xác khoảng 40 mg triamcinolone acetonide chuẩn với metalnol và cho methanol đủ thành 200 ml (dung dịch có nồng độ khoảng 200 μg/ ml. Hút chính xác 20 ml dung dịch này cho vào bình định mức 50 ml thêm dung dịch chuẩn nội cho đủ thể tích, trộn đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm.
Dung dịch thử: Lấy 10 ống thuốc, trộn đều, hút chính xác 1 ml chế phẩm hòa tan với methanol và cho đủ thành 200 ml (200 μg/ ml). Hút chính xác 20 ml dung dịch này cho vào bình định mức 50 ml thêm dung dịch chuẩn nội vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 μm.
Tiến hành tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký. Ghi lại sắc ký đồ.
Hàm lượng triamcinalone acetonide so với hàm lượng ghi nhãn được tính theo công thức sau:
400 mg x x C% x 2 x (mg) (2.3.2)
UT: Tỷ lệ giữa chiều cao của pic triamcinalone acetonide với chiều cao của pic chuẩn nội thu được trong mẫu thử.
UC: Tỷ lệ giữa chiều cao của pic triamcinalone acetonide với chiều cao của pic chuẩn nội thu được trong mẫu chuẩn.
C%: hàm lượng % của mẫu chuẩn triamcinalone acetonide.
80: hàm lượng triamcinalone acetonide ghi nhãn (80 mg/2ml). [42]
2.3.3. Phương pháp đo độ nhớt
Mỗi loại nhít kế mao quản có một hằng số dụng cụ (k) riêng. Cách xác định độ nhít bằng nhít kế Ostwald:
Chuẩn bị dụng cô: rửa sạch nhít kế bằng hỗn hợp sulfocromic, sau đó
bằng nước thường rồi bằng nước cất, ethanol. Cuối cùng rửa bằng ether hoặc aceton và làm khô.
Cho nước vào khoang của bộ điều nhiệt, đặt nhiệt độ tại 20 oC cho nhiệt độ ỏn định. Nối bộ đếm thời gian với đầu đọc thời gian.
Lắp mao quản: chọn mao quản có hệ số k thích hợp (k = 0.00527, sao
cho thời gian chảy qua mao quản ≥ 200 giây), lắp mao quản vào đầu đọc sao cho mao quản thẳng đứng và chìm hết bầu chứa trong môi trường điều nhiệt, dùng pipep dài cho chất lỏng cần đo vào bầu chứa của mao quản qua ống.
Đo: kiểm tra nhiệt độ trên màn hình của bộ điều nhiệt để đảm bảo nhiệt
độ ở 20oC ± 0,1oC. Khi nhiệt độ ổn định, tế bào quang điện ổn định, dùng quả bóp cao su thổi từ miệng ống để chất lỏng dâng lên quá ngấn chuẩn của cửa sổ phía trên đầu đọc, bá qủa bóp cao su khỏi miệng ống để chất lỏng về bầu chứa. Khi vòng khum của bề mặt chất lỏng đi qua cửa sổ phía trên đầu đọc, bộ phận đếm thời gian sẽ tự động đếm cho đến khi vòng khum của bề mặt chất lỏng đi qua cửa sổ phía dưới của đầu đọc thì tự động dừng lại. Kết quả đếm thời gian được hiển thị bằng số giây trên bộ đếm thời gian. Làm nh vậy 5 lần, lấy trung bình cộng của các kết quả đo được làm thời gian t cần xác định. Sai số các kết quả đo không vượt quá 0,5%. [1, 14, 22, 31]
Tính độ nhít tuyệt đối η hoặc độ nhít động học ν lần lượt theo công thức sau:
ν = k.t (2.3.3.2) Trong đó:
η: Độ nhít tuyệt đối (mPa.s hoặc cP) ν: Độ nhít động học (mm2/s hoặc cSt) k: Hằng số dụng cụ đo
ρ: Khối lượng riêng của chất lỏng đem thử (g/cm3) t: Thời gian chảy (giây).
Thực nghiệm đo độ nhớt được tiến hành trên dụng cụ đo được mô tả ở
hình 2.3.3 sau:
Hình 2.3.3. Máy đo độ nhớt Prolabo.
2.3.4. Phương phỏp xác định chỉ số cân bằng thân dầu thân nước HLB tối ưu cho công thức bào chế hỗn dịch (Hydrophil Lypophil Balance).
Chất hoạt động bề mặt dùng trong hỗn dịch có vai trò gây thấm và gây phân tán cần được đánh giá về chỉ số HLB nhằm chọn được tá dược phù hợp với dược chất có trong công thức và đảm bảo tính chuẩn xác của nguyên liệu đưa vào quy trình sản xuất.
Phương pháp thực nghiệm xác định chỉ số HLB của một chất hoạt động bề mặt dựa trên HLB tối ưu để bào chế được hỗn dịch có kích thước tiểu phân
trung bình tối thiểu.
Nguyên tắc: xác đinh HLB tối ưu của hỗn hợp 2 chất hoạt động bề mặt đã biết chỉ số HLB cần cho 1 hỗn dịch.
- Sử dụng 1 cặp chất diện hoạt A và B (đã biết chỉ số HLB) với các tỷ lệ khối lượng thay đổi để có được HLB của hỗn hợp biến đổi trong khoảng
HLB cần khảo sát, tính theo công thức: (2.3.3) Trong đó chất A có a gam và chất B có b gam
- Điều chế một loạt các mẫu hỗn dịch có cùng tỷ lệ các thành phần và chất nhũ hoỏ cú HLB thay đổi khác nhau trong cùng quy trình bào chế. Sau đó xác định hỗn dịch có độ bền trạng thái tập hợp tốt nhất (kích thước tiểu phân trung bình nhỏ nhất hoặc tốc độ sa lắng nhỏ nhất) bằng phương pháp sa lắng hoặc phương pháp li tâm. HLB của hỗn hợp chất diện hoạt trong mẫu thử tìm được là HLB tối ưu. [18]
2.3.5. Phương pháp xác định kích thước tiểu phân trong hỗn dịch
Nguyên lý chung đo kích thước hạt bằng phương pháp tán xạ Lazer:
Khi chiếu chùm tia lazer vào các hạt có kích thước khác nhau ta sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau. Dùa vào mức tán xạ của chùm tia sau khi va đập vào hạt ta có thể tính được kích thước hạt theo thuyết Mie. [34]
Phương pháp tán xạ lazer đưa ra kết quả tỷ lệ phần trăm thể tích của các hạt theo đường kính hạt. Khi chiếu tia lazer tới hạt thì tại rìa hạt xảy ra hiện tượng tán xạ ánh sáng mạnh do đó trên nền ta thu được hình ảnh của hạt trên nền (detector nhận biết hình ảnh) được mô tả như hình 2.3.4.1.
Hình 2.3.4.1. Mối liên quan giữa bề mặt hạt và sự giao thoa tán xạ.
Thông thường để đánh giá một cách chuẩn xác người ta dùng hệ số giao thoa tán xạ trên một micromet:
SCPM = Csca x (4πr3/3) (2.3.4.1) Hệ số giao thoa tán xạ được tính theo công thức:
S (μm-1) = 0.75.(1 – cosθ).SCPM (2.3.4.2) Trong đó: cosθ là cosin của góc tán xạ trung bình.
Từ phân tích mối tương quan giữa kích thước tiểu phân và S (μm-1) ta tính được kích thước tiểu phân của hạt được mô tả tại hình 2.3.4.2.
Hình 2.3.4.2. Mối tương quan giữa S (μm-1) và kích thước tiểu phân
Máy phõn tích kích thước tiểu phân dựa trên sự tán xạ và nhiễu xạ của ánh sáng khi đi qua rìa tiểu phân để tính toán ra kích thước tiểu phân theo nguyên lý trình bày trên. [15, 18]
Máy được kết nối với máy tính và có phần mềm xử lý số liệu để thống kê đưa ra kết quả đo phân bố kích thước tiểu phân. Máy đo kích thước tiểu phân Horiba LA- 950 được mô tả tại hình 2.3.4.3. Nguyên lý cấu tạo của máy gồm các nguồn lazer được chiếu vào dịch đo. Tại dịch đo có sự tán xạ và giao thoa các tia tán xạ được nhận biết bằng các detector khác nhau (hình 2.3.4.4).
Hình 2.3.4.3. Máy đo kích thước tiểu phân HORIBA LA- 950
Hình 2.3.4.4. Nguyên lý cấu tạo máy đo kích thước tiểu phân HORIBA LA- 950
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu và quy hoạch thực nghiệm
Dùng phần mềm Modde 5.0, Microsolf Office Excel 2003. [46, 47, 48]
2.3.7. Phương pháp lão hóa cấp tốc.
Các mẫu hỗn dịch được đóng ống, lọ thủy tinh nút cao su kín được bảo quản ở 40 oC ± 2 oC, nhằm tăng nhanh thời gian phân hủy của thuốc về mặt vật lý, hóa lý, hóa học và sinh học để rút ngắn thời gian theo dõi đánh giá. Sau các mốc thời gian thiết kế (1, 7, 10, 20, 30, 45, 60, 90 ngày) lấy mẫu đem xác định các chỉ tiêu chất lượng của hỗn dịch. [12]
2.3.8. Phương pháp bào chế hỗn dịch tiêm triamcinolon acetonid
Nguyên tắc:
+ Nghiền mịn triamcinolone acetonid, sau đó qua rây 90 mcm.
+ Phân tán triamcinolon acetonid đã qua rây vào dung dịch chất diện hoạt, khấy đều để đồng nhất hóa.
+ Thêm từ từ dung dịch chất ổn định làm tăng độ nhớt vào hỗn dịch trên, khấy đều để đồng nhất hóa.
đều để đồng nhất hóa, điều chỉnh pH và thể tích hỗn dịch cho vừa đủ.
+ Cuối cùng hỗn dịch được đồng nhất hóa bằng khuấy từ và siêu âm.
Chú ý: Triamcinolon nguyên liệu là vô khuẩn và các dung dịch chất ổn định, đệm pH phải được tiệt khuẩn bằng cách hấp hoặc luộc sôi trước khi đưa vào pha chế. Các giai đoạn pha chế thực hiện trong điều kiện vô khuẩn.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Khảo sát để đánh giá các phương pháp xác định một số chỉ tiêu vật lý, hóa lý của một số hỗn dịch tiêm Triamcinolon acetonid lưu hành trên thị trường.
Khảo sát tại thời điểm ban đầu: Lấy hai mẫu hỗn dịch tiêm Triamcinolo acetonid 80 mg/ 2ml lưu hành trên thị trường lắc mạnh đều trong 2 phút, để yên trong 8 giờ sau đó đem tiến hành khảo sát các chỉ tiêu vật lý, hóa lý: R sa lắng, phân bố kích thước tiểu phân, pH, thế zeta và độ nhớt. Mỗi mẫu tiến hành 06 thí nghiệm xác định các chỉ tiêu trên theo các phương pháp đo mục 2.3 chương 2, ta có kết quả ở bảng 3.1.1.
Bảng 3.1.1. Kết quả khảo sát các chỉ tiêu vật lý, hóa lý lúc ban đầu.
STT Mẫu 1 Mẫu 2 Rsl KTTB SD pH ζ η Rsl KTTB SD pH ζ η 1 50.11 12.27 6.47 6.46 -48.35 1.2874 56.75 9.12 4.99 6.26 -54.87 1.4141 2 49.52 12.35 6.32 6.45 -48.26 1.2980 56.44 9.21 5.07 6.23 -54.69 1.4193 3 49.17 13.02 6.79 6.48 -49.17 1.319 1 56.23 10.06 5.18 6.18 -54.78 1.4352 4 48.89 12.86 6.49 6.45 -48.61 1.303 3 55.78 9.68 5.15 6.25 -54.28 1.4246 5 49.18 12.70 6.24 6.46 -49.62 1.313 8 56.37 9.53 5.09 6.20 -54.40 1.4299 6 49.02 12.47 6.38 6.42 -48.52 1.308 5 56.82 9.69 5.13 6.19 -54.71 1.4193 TB 49.73 12.61 6.45 6.45 -48.76 1.305 0 56.40 9.51 5.01 6.22 -54.60 1.4237 SD 0.43 0.27 0.17 0.02 0.48 0.010 4 0.35 0.34 0.07 0.03 0.29 0.0070 RSD 0.87 2.15 0.28 -0.99 0.7970 0.61 3.59 0.49 -0.54 0.4917
2.71 1.39
Khảo sát sau 01 tháng lão hóa: Lấy hai mẫu hỗn dịch tiêm