mực hại cây Quế
Sử dụng kéo cắt cành, cưa và dao chuyên dụng kết hợp với thang và ống nhòm thu thập mẫu bệnh tua mực Quế.
b. Phương pháp phân lập và định danh chính xác đến loài tác nhân gây bệnh tua mực hại cây Quế
- Với mầm bệnh là nấm gây bệnh
Phương pháp phân lập nấm trực tiếp từ mô bệnh theo Marin và đồng tác giả (2014). Dùng dao chuyên dụng vô trùng cắt nhỏ mô bệnh đưa vào môi trường PDA, ủ 8-24 giờ trong bóng tối ở 23oC. Tách hệ sợi bằng phương pháp cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm, và làm thuần.
Mô tả hình thái mẫu: Mẫu tươi được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét, mẫu bệnh được cắt thành các đoạn 7mm và cố định bằng glutaraldehyte 2.5%v/v trong dung môi 0,06M KH2PO4 (pH6,8) qua đêm ở 4oC. Các mẫu được rửa với dung dịch đệm và sau cố định 2 giờ ở 4oC (dung dịch đệm 1% osmium tetroxit (OsO4)). Các mẫu được rửa sạch bằng nước cất, sau đó được làm khô bằng cồn ở (25%, 50%, 75%, 95%) đến 100% và được làm khô bằng máy sấy rồi tiến hành soi mẫu.
Hệ sợi được soi theo phương pháp của Marin và đồng tác giả (2014) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm, bằng cách lấy một lam kính đã khử trùng cắt một miếng thạch 1cm2 đặt lên rồi lấy hệ sợi phân lập ở trên cấy vào ria của miếng thạch, sau đó úp lamen vào rồi đặt tất cả vào một đĩa petri vô trùng, sau 20 đến 48 giờ tiến hành soi mẫu dưới kính hiển vi BX50.
Giám định mẫu: Bằng phương pháp tách ADN của hệ sợi nấm đã được nuôi trong 2-3 tuần trong điều kiện 23oC ủ tối. Lấy khoảng 50mg hệ sợi và thêm vào 1ml dung dịch tách (50mM EDTA pH8, 100mM Tris pH8, 3,5% SDS, 250µg/ml proteinase K, 1% bisulfit natri (NaHSO3), mẫu được vortex trong 1 phút và ủ ở 65oC trong 15 phút. Sau đó các mẫu được vortex lại trong thời gian ngắn và ly tâm ở gia tốc 14 000g trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi và thêm vào 200µl 7.5M natri axetat, vortex trong 10 giây, đặt trên đá bào trong 15 phút và ly tâm ở gia tốc 14.000g trong 3 phút. Loại bó dịch nổi và thêm vào 700µl isopropanol, nhẹ nhàng trộn để kết tủa ADN và ly tâm ở gia tốc 14.000g trong 5
phút. Các dịch nổi được loại bỏ và kết tủa được rửa sạch hai lần với cồn 70%, làm khô mẫu và khi nào dùng thì cho 100µl H2O vô trùng vào.
Sử cặp mồi NL1 và NL4 (O'Donnell 1993) để giám định mẫu. Công thức PCR được thực hiện với dung tích 50 µL phản ứng bao gồm 5 µL 10x ExTaq đệm (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Nhật Bản), 5µl 2,5 mM dNTPs, 2,5 µl 10mM primer, 1 U ExTaq (Takara Bio Inc.) và mẫu DNA 1 mL (10-200 ng/µL). Chu trình chạy như sau gia nhiệt là 94oC trong 2 phút, 40 chu kỳ là 94oC trong 30 giây, 55oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây sau đó là 72oC trong 5 phút. Sản phẩm được chạy điện di trên bản gel agarose 1% (w/v). Sản phẩm PCR được làm sạch với các cột spin QIAquick (QIAGEN, Valencia, California). Tất cả các ADN được giải trình tự bằng bộ phân tích ADN tự động 3730xl, tất cả các gen được sắp xếp theo cả hai hướng với các mồi NL1 và NL4. Các trình tự được sắp xếp và chỉnh sửa trên Genious 6 (Biomatters Ltd., Auckland, New Zealand).
- Với mầm bệnh là dịch khuẩn bào (Phytoplasma)
Phương pháp phân lập trực tiếp từ mẫu tua mực
+ Chuẩn bị môi trường
Chuẩn bị môi trường lỏng để phân lập Phytoplasma: môi trường TSB (Oxoid, UK, CM1065) pH 7,3 ± 0,2. Môi trường TSB được khử trùng ở 121°C trong 20 phút, được bổ sung thêm 20 ml huyết thanh ngựa (Oxoid, SR0035), 25 μg/ml ampicillin (Sigma, A9393), và 50 μg/ml nystatin (Sigma, N6261) khử trùng cả bộ lọc có đường kính 0,22 μm, 10 ml cao nấm men (25% w/v) và 0,005% phenol đỏ cho vào 80 ml môi trường. Môi trường sau này được đặt tên là CBl (TSB làm môi trường gốc).
+ Phân lập mẫu
Phân lập mẫu bệnh tua mực hại Quế, dùng dao phẫn thuật cắt những tua mực thành những đoạn dài từ 3 đến 5 cm, khử trùng bề mặt bằng 1%NaClO trong 1 phút, sau đó rửa lại ba lần nước cất và làm khô mẫu bằng giấy thấm vô trùng trong đĩa petri sạch, sau đó cắt mẫu thành các lát nhỏ bằng dao mổ vô trùng rồi ngâm mẫu trong 5ml môi trường lỏng môi trường TSB dùng ống Monovette hút chân không và ủ ở 25oC trong điều kiện nhiệt độ phòng. Mẫu đối
chứng để trong ống không ủ và các ống ủ chứa vỏ Quế không bị bệnh tua mực cũng được để trong điều kiện như trên. Quá trình phân lập được lặp lại 2 lần cho mỗi mẫu.
Khi dung dịch chuyển từ mầu cam đỏ sang cam vàng, lấy 100 µl dung dịch đó trang trên đĩa petri có chứa sẵn 8ml môi trường rắn CBs.
Sau 1 đến 2 ngày trang lên môi trường thạch các khuẩn lạc đơn lẻ xuất hiện và được tách chuyển sang môi trường lỏng để làm thuần. Sau khi môi trường lỏng thay đổi sẽ được lọc tiếp qua bộ lọc 0,8µm sử dụng bộ lọc ống tiêm của Sartorius Stedim (Công nghệ sinh học, Đức) sau đó lấy 100 μl dung dịch đã qua lọc trang trên môi trường mới; quá trình này được lặp lại 3 lần cho mỗi mẫu phân lập trên môi trường khi có sự hình thành khuẩn lạc. Sau các giai đoạn trên tiếp tục lấy một khuẩn lạc và chuyển sang môi trường lỏng sau 2 ngày ủ pha loãng tới hạn đến 10-3 và 10-4. Quá trình này lặp lại 2 lần cho mỗi chủng phân lập được.
Sau 2 đến 5 ngày khuẩn lạc già tiến hành chụp ảnh khuẩn lạc trên đĩa petri dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 40x. Các khuẩn lạc riêng lẻ được lấy rửa trong 100µl nước cất và nước cất vô trùng để dùng DNeasy Plant Minikit (Qiagen, Germany) tách thu axit nucleic.
- Giám định các chủng Phytoplasma từ khuẩn lạc thu được
Việc phát hiện và nhận diện Phytoplasma từ các khuẩn lạc thu được bằng biện pháp Nested PCR/RFLP để khuếch đại gen 16S rRNA của phytoplasmas (Fabre et al., 2011). Mẫu sử dụng là 1 µm axit nucleic tách triết ở trên, có thể sử dụng một số cặp mồi là B5/P7 sau đó khuếch đại lồng nhau với mồi M1/B6 (Gibb et al., 1995; Padovan et al., 1995) hoặc cặp sử dụng cặp mồi R16F2n/R2 (Gundersen và Lee, 1996), tiếp theo là PCR lồng nhau với các cặp mồi F1/R1 R16 (I) (Lee et al., 1994). Trong mỗi thí nghiệm PCR và nested-PCR, hai mẫu đối chứng âm dùng nước và mẫu đối chứng sạch bệnh. Lấy 25 μl phản ứng PCR gồm 12,5 μl của 2x Red PCR Master Mix (Rovalab, Germany), và 0,4 mM của mỗi mồi. Thử nghiệm Nested-PCR được thực hiện bằng cách sử dụng 1 μl dung dịch pha loãng tỷ lệ 1:30 trực tiếp từ sản phẩm PCR làm mẫu. Trạng thái chu
trình được chỉ ra cho gen 16Sr RNA và các gen mẫu được khuếch đại lần lượt (Schaff et al., 1992, Fabre et al., 2011). 6μl của các sản phẩm PCR được chạy trên bản gel agarose 1%, nhuộm với Red safe chạy điện di với hiệu điện thế 100V trong 30 phút. Và sản phẩm được đọc trên máy soi chụp UV FireReader V4/UVITEC/Pháp. Xác định các phytoplasmas đã phân lập được bằng cách sử dụng các phân tích RFLP với các enzyme khống chế Tru1I và TaqI (Fermentas, Vilnius, Lithuania). Các sản phẩm RFLP được tách ra trên gel polyacrylamide 6,7%, nhuộm bằng Red safe và kết quả đọc trên máy soi chụp UV ở trên. Sau đó tiến hành giải trình tự trực tiếp 10 sản phẩm PCR được lựa chọn từ mỗi chủng phytoplasma phân lập được; các chuỗi đã được lắp ráp bằng cách sử dụng chương trình Staden (Staden et al., 2000), được sắp xếp theo Clustal X (Thompson et al., 1997).
- Tách chiết ADN trực tiếp từ mẫu tua mực hại cây Quế để xác định sinh vật gây bệnh
+ Tách DNA từ cây khỏe mạnh và tại vị trí của cây bị bệnh tua mực Quế theo phương pháp của Ausubel và đồng tác giả (1987) có cải tiến. Mẫu mẫu lấy khoảng 1g mô bị bệnh hoặc vỏ cây khỏe mạnh, cắt nhỏ cho vào cối sứ đã khử trùng cho một lượng Ni tơ lỏng vào mẫu và nghiền. Sau đó cho thêm vào 10ml DNA extraction buffer (100mM Tris-HCl (pH8,0), 100mM EDTA, 250mM NaCl, 100mg proteinase K/ml). Trong mẫu này, thêm vào 1ml SDS10% và 0,5 sarkosyl 20%. Mẫu được ủ ở 55oC trong 1 giờ và ly tâm ở gia tốc 3.000g trong 10 phút để loại bỏ các chất. Kết tủa AND bằng cách thêm 2ml cồn 95% để ở - 20oC qua đêm để kết quả AND. Sau đó ly tâm ở gia tốc 16.000g trong 15 phút, loại bỏ dung dịch bên trên thêm vào 1ml dung dich TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA {pH8.0}) chứa 100mg proteinase K/ml và 0,5%SDS ủ ở 37oC trong 1 giờ, sau đó thêm 175ml NaCl 5M và 140 ml CTAB10% (cetyltrimethylammonium bromide) trong 0,7M NaCl. Hỗn hợp được ủ ở 65oC trong 10 phút,sau đó cho vào hỗn hợp Phenol bằng với hỗ hợp chloroform: isoamylalcohol theo tỷ lệ (24: 1). Sau đó mẫu được rửa ít nhất hai lần với 2 hỗ hợp chloroform-isoamylalcohol (24: 1). Hai dung dich cồn 95% và 1/10 thể tích
NaOAc 3M được thêm vào với nước và đặt ở nhiệt độ -70oC trong ít nhất 1 giờ. DNA được kết tủa bằng cách ly tâm ở gia tốc 16.000g trong 15 phút. Các viên sau đó được rửa sạch với cồn 70%, sấy khô và tái kết tủa trong bộ đệm 1ml TE.
+ Sử dụng hai cặp mồi theo Lee và đồng tác giả (1993) là R16F2, 5‘-
ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3' và R16R2, 5'-
TGACGGGCGGTGTGTACA AACCCCG-3’.
+ Khuếch đại PCR
Tổng số đoạn DNA được khuếch đại từ 10µl mẫu DNA pha loãng 2 lần được chiết xuất từ mẫu bệnh tua mực Quế, và các cây khỏe mạnh không bị nhiễm bệnh. Khuếch đại được thực hiện trong hỗn hợp phản ứng 100µl PCR gồm 200µM mỗi loại dATP, dCTP. dGTP, và dTTP, 1µM mồi xuôi và mồi ngược, 10µl của bộ đệm phản ứng PCR 10x; 2,5mM MgCl2 (Promega Corp.); 2,5U Taq DNA polymerase (Promega Corp), và 30µl dầu khoáng. Phản ứng PCR được thực hiện trong 45 chu kỳ trong Biooven (Biotherm, Virginia) trong các điều kiện sau: chu trình lần 1, biến tính trong 5 phút ở 94oC; ủ 2 phút ở 50oC; kéo dài 3 phút tại 72oC (lặp lại 43 chu kỳ), biến tính trong 1 phút ở 94oC; chu kỳ cuối cùng, kéo dài 7 phút tại 72oC. Biến tính và gia nhiệt giống như chu kỳ đầu tiên.
+ Làm bản gel agarose 1% và nhuộm Red safe sau đó soi và chụp dưới máy FireReader 4/UVITEC.