sinh trưởng của cây Kim tiền thảo
Cây Kim tiền thảo in vitro được tạo ra trên môi trường cảm ứng ra rễ được huấn luyện trong nhà lưới 10 ngày để cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên trước khi ra ngôi. Sau thời gian huấn luyện, cây con được trồng vào bầu với các giá thể khác nhau để nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần giá thể đến tỷ lệ cây sống và sinh trưởng của cây Kim tiền thảo in vitro tại vườn ươm. Đặc biệt ở giai đoạn đầu, thành phần ruột bầu phải vừa có khả năng giữ nước, tạo độ m giúp cây con hút chất dinh dưỡng nhưng cũng cần thoáng khí để cây con không bị thối rễ (Bùi Văn Thắng và CS, 2016 .
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống, sinh trƣởng của cây Kim tiền thảo
Kí hiệu giá thể Thành phần giá thể Tỷ lệ sống (%) Chiều cao TB/cây (cm)
Đặc điểm cây giống
B1 Đất tầng B 15,03 3,04 ±
0,04a
Sinh trưởng kém, lá vàng
Kí hiệu giá thể Thành phần giá thể Tỷ lệ sống (%) Chiều cao TB/cây (cm)
Đặc điểm cây giống
B2 25% cát vàng + 75% đất tầng B 18,07 3,49 ± 0,05a Sinh trưởng kém, lá vàng B3 50% cát vàng + 50% đất tầng B 81,93 5,65 ± 0,02c Sinh trưởng tốt, lá xanh đậm B4 75% cát vàng +25% đất tầng B 52,69 4,19 ± 0,03b Sinh trưởngkém, lá xanh B5 100% cát vàng 16,34 3,37 ± 0,02a Sinh trưởng kém, lá vàng Sig 0,0001 0,0001
Biểu đồ 3.5: Tỉ lệ cây sống và chiều cao TB của cây Kim tiền thảo đƣợc nuối cấy trong các công thức thí nghiệm.
15.03 18.07 81.93 52.69 16.34 3.04 3.49 5.65 4.19 3.37 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 2 3 4 5
Trong thí nghiệm này, đã bố trí 5 công thức thí nghiệm có thành phần giá thể khác nhau(Bảng 3.5 .Sau khi trồng cây vào bầu, xếp bầu theo luống trong nhà lưới có mái che, tưới nước 2 lần/ngày đảm bảo độ m cao. Sau khi trồng 7 tuần, tiến hành thống kê các chỉ tiêu về tỷ lệ sống, chiều cao và đặc điểm sinh trưởng của cây con. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6.
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.6 cho thấy công thức B3 cho tỷ lệ cây sống và chiều cao cây trung bình lớn nhất, lần lượt là 81,93% và 5,65 cm. Ở công thức thí nghiệm B1 cho tỷ lệ sống là thấp nhất (15,03%) và chiều cao trung bình của cây cũng kém nhất (3,04 cm). Kết quả kiểm tra thống kê cho thấy các chỉ tiêu về tỷ lệ sống cũng như chiều cao cây trung bình có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm là có ý nghĩa (Sig = 0,0001 < 0,05 . Như vậy, khi thay đổi tỷ lệ các thành phần giá thể thì tỷ lệ cây sống cũng như chiều cao trung bình/cây đều có sự khác biệt giữa các công thức. Thành phần ruột bầu thích hợp nhất là ở công thức B3 (50% cát vàng + 50% đất tầng B) và cây sinh trưởng, phát triển khỏe, lá xanh tốt. (Hình 3.16)
KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 1. Kết uận
Phân tích trình tự ADN m vạch
- Đã tách chiết thành công ADN tổng số từ 4 mẫu Kim tiền thảo.
- Đã xác định được 04 trình tự ADN mã vạch cho loài Kim tiền thảo là trình tự matK, rbcL, ITS, và ycf1b.
- Đánh giá được hiệu quả giám định loài Kim tiền thảo dựa vào 04 trình tự ADN mã vạch theo thứ tự sau: ITS>matK >ycf1b >rbcL.
Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro oài Kim tiền thảo cụ
thể nhƣ sau:
- Kết quả nghiên cứu cho thấy các công thức tốt nhất để tiến hành nhân giống in vitro cây KTT là:
Sát khu n bề mặt mẫu hạt bằng ethanol 70% trong 1 phút, khử trùng bằng dung dịch Javen 8% trong 7 phút và nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng MS (Murashige and Skoog, 1962) bổ sung 30 g/l sucrose và 6,5 gr/l agar, cho tỷ lệ mẫu sạch là 87,12%, mẫu nảy mầm đạt 59,11%.
- Nhân nhanh chồi bằng môi trường MS cơ bản bổ sung 1,0 mg/l 6-BAP, 0,3 mg/l Kinetin, 0,1 mg/l α-NAA, bổ sung 100 ml/l nước dừa, 30 gr/l sucrose và 6,5 gr/l agar, cho hệ số nhân chồi đạt 7,22 lần/ chu kỳ nhân; cho tỷ lệ chồi hữu hiệu là 74,09% .
- Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường MS bổ sung 0,3 mg/l α-NAA, 0,1 gr/l than hoạt tính, 20 gr/l sucrose và 6,5 gr/l agar với tỉ lệ ra rễ đạt 95,66%, 8,33 rễ/cây và chiều dài trung bình rễ là 3,41 cm.
- Thành phần ruột bầu tốt nhất để ươm cây Kim tiền thảo in vitrolà (50% cát vàng + 50% đất tầng B) cho tỷ lê cây sống cao nhất đạt 81,93%, chiều cao cây trung bình lớn nhất là 5,65 cm, cây sinh trưởng tốt, lá xanh đậm.
2. Tồn tại
Do hạn chế về thời gian thực hiện nên đề tài chưa nghiên cứu được các yếu tố ảnh hưởng đến cây Kim tiền thảo ở giai đoạn vườn ươm như chế độ che sáng, bón phân, tưới nước.
3. Kiến nghị
Tiếp tục bố trí các thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ che sáng, bón phân, và tưới nước đến sự sinh trưởng và phát triển của cây con Kim tiền thảo ở giai đoạn vườn ươm để đưa ra được quy trình nhân giống in vitro hoàn chỉnh cho loài Kim tiền thảo.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhi, Lê Thị Muội (1997 . Công nghệ inh h c thực vật trong cải tiến giống cây trồng.Nhà xuất bản Nông Nghiệp.
2. Hoàng Cảnh (2006 , rầm hương và loại cây tạo ra trầm hương lợi ch thách thức và triển v ng. Hội trầm hương Việt Nam.
3. Lê Văn Chi (1992). Cách sử dụng chất điều hòa sinh trưởng và vi lượng hiệu quả cao. Nhà xuất bản Khoa học – Kỹ thuật, Hà Nội.
4. Võ Văn Chi (1997 . ừ điển cây thuốc Việt Nam. NXB Y học, TP.Hồ Chí Minh.
5. Hoàng Đăng Hiếu(2012). Sử dụng các kỹ thuật sinh h c phân tử trong phân t ch và định dạng của tập đoàn cây D Bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh. Luận văn Thạc sỹ ngành Sinh học.
6. Hà Văn Huân và cộng sự (2015 , Xác định đoạn mã vạch DNA cho Trà hoa vàng Tam đảo (Camellia tamdaoensis : loài cây đặc hữu của Việt Nam.Tạp chí Nông nghiệp và PTNT (2015 , 5:123-130
7. Lê Thanh Hương, Nguyễn Nhật Linh, Bùi Mạnh Minh, Hà Hồng Hạnh, Huỳnh Thị Thu Huệ, Nông Văn Hải, Hà Văn Huân, Lê Thị Thu Hiền (2017).
Ứng dụng mã vạch DNA h trợ định loại loài một số mẫu sâm thuộc chi nhân sâm (Panax L. , tạp chí Công nghệ sinh học 15(1 :63-72.
8.Đỗ Tất Lợi (1999 . Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học, Hà Nội. 9. Phan Kế Long, Vũ Đình Duy, Phan Kế Lộc Nguyễn Giang Sơn, Nguyễn thị
Phương Trang, Lê thị Mai Linh, Lê Thanh Sơn (2014 . Mối quan hệ di truyền của các mẫu sâm thu ở Lai Châu trên cơ sở phân tích di truyền trình tự nucleotide vùng matk và ITS-rDNA. Tạp chí công nghệ sài gòn, 2: 327-337.
10. Nguyễn Minh Ngọc (2013 , Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa h c của cây mũi mác (Desmodium triquetrum h đậu (fabaceae) m c hoang ở Bắc Kạn. Luận văn thạc sĩ dược học, Trường đại học dược Hà Nội.
11. Đoàn Thị Nhu (2013 . Kim tiền thảo điều trị sỏi niệu sỏi mật vi m gan vi m thận. Báo Tiền Phong, Tp. Hồ Chí Minh.
12. Lê Công Mạnh (2019 .Khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu xác định ADN mã vạch cho loài lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata ”
13. Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương (2005 , Nghi n cứu hoàn thiện quy tr nh nhân nhanh cây rinh nữ hoàng cung b ng phương pháp in vitro.
Những vấn đề cơ bản của sự sống trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, Hà Nội 3/11/2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 722-724
14. Nguyễn Quang Thạch (2000). Giáo trình sinh lý thực vật. NXB Nông Nghệp I, Hà Nội
15. Nguyễn Quang Thạch, Lý Thị Anh (2000 . Bài giảng môn h c công nghệ sinh h c thực vật – Trường Đại Học Nông nghiệp I, Hà Nội.
16. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo tr nh Công nghệ sinh h c nông nghiệp NXb Nông Nghiệp Hà Nội.
17. Bùi Văn Thắng, Cao Việt Nga, Bùi văn Kiên, Nguyễn Văn Việt (2016 ,Nhân giống cây Đảng sâm (Codonopsis javanica) b ng kĩ thuật nuôi cấymô. Tạp chí khoa học và công nghệ Lâm nghiệp, 4: 3-9.
18. Nguyễn Văn Uyển (1993 . Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống cây trồng. Nxb Nông nghiệp, tr. 23-44.
19. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mậu Hùng, Lê Hồng Điệp (2005 . Công nghệ sinh h c (tập 2). Nhà xuất bản Giáo Dục.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
20. Baharum, S.N. (2012 , “Application of 16s rDNA DNA cytochrome b ribosomal markers in studies of lineage ADN fish populations structure of aquatic species” Molecular biology reports, 39 (5): 5225-5232.
21. Casiraghi, M., Labra M., Ferri E., Galimberti A., De Mattia F. (2010 , “DNA barcoding: theoretical aspects and practical applications”.
22. CBOL Plant Working Group (2009 ,“A DNA barcode for lDNA plants”106: 12794 -12797.
23. Chase, M.W., Cowan R.S. (2007 , “A proposal for a stADNardised protocol to barcode all lADN plants” Taxon, 56 (2): 295-299.
24. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, Shi L, Zhu Y, Ma X, Gao T, Pang X, Luo K, Li Y, Li X, Jia X, Lin Y, Leon C (2010 ,“Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species”, PloS one, 5 (1): e8613.
25. Chiou, S.-J, Yen J.-H. Fang C-L., Chen H,-L., ADN Lin T-Y.(2007), “Authentication of medicinal herbs using PCR- amplified ITS2 with specefic primers”, Planta medica, 73 (13 : 1421 – 1426.
26. Costion CM, Kress WJ, Crayn DM. (2016 , “DNA Barcodes Confirm the Taxonomic and Conservation Status of a Species of Tree on the Brink of
Extinction in the Pacific”. PLoS One11(6).
27. Doyle J.J., Doyle J.L. (1990 “Isolation of plant DNA from fresh tissue”
Focus. 12: 13-15
28. Ford, C.S., Ayres K.L. (2009), “ election of cDNAidate coding DNA barcoding regions for use on lDNA plants”, Botanical Journal of the Linnean Society, 159 (1): 1-11.
29. Gao S., Zhang J., Ding P., Wang Z., Li Q., Peng S. (2003 ,“Genomic DNA
Extraction fromMorinda officinalisHow”. Chinese journal of tropical agriculture, Issue 4, P: 22-24
30. Gao T.Y.H., Song J., Mori S.A., Pe Tronelli (2009 , “Indentyficiation of medicinal plants in the family fabaceae using a potential DNA barcode ITS2”,Journal of Ethnopharmacology (130 : 116-121.
31. Group C.P.W., Hollingsworth P.M. (2009 , “DNA barcode for lADN plants”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 106 (31): 12794-12797 32. Hebert, P.D., Cywinska A., ADN Ball S.L. (2003 , “Biological
identifications through DNA barcodes”, Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 270 (1512): 313-321.
33. Hebert, P.D., Penton E.H., Burns J.M., Janzen D.H., ADN Hallwachs W. (2004 , “Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101 (41): 14812-14817.
34. Hebert, P.D., Ratnasingham S., De Waard J.R. (2003 , “Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species”, Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 270 (Suppl 1): S96-S99.
35. Hilu K.W.L.H. (1997 , “The matK gene: secuence variation DNA amplification in plant systematic”, American journal of Botany 84: 830-839. 36.Hollingsworth, M.L., Clark A. (2009 , “Selecting barcoding loci for plants:
evaluation of seven cDNAidate loci with species‐level sampling in three divergent groups of lDNA plants”, Molecular Ecology Resources, 9 (2): 439-457.
37.Hollingsworth, P.M. (2011 , “Refining the DNA barcode for lADN plants”,Proceedings of the National Academy of Sciences, 108 (49): 19451-19452. 38. Hollingsworth, P.M., Graham S.W., Little D.P. (2011 , “Choosing ADN
using a plant DNA barcode”, PloS one, 6 (5): e19254.
39. Kress J.W. K.J ., ZimmerE.A., Weight, L.A. & Janzen DH. (2005 , “Use of DNA barcodes to identyfy flowering plants”, Proc Natl Acad Sci USA, 102: 8369-8374.
40. Lichao Jiao, Min Yu, Alex C. Wiedenhoeft, Tuo He, Jianing Li, Bo Liu, Xiaomei Jiang, Yafang Yin (2018 ,“DNA Barcode Authentication and Library Development for the Wood of Six Commercial Pterocarpus Species: the Critical Role of Xylarium pecimens” Scientific report 31/1/2018.
41. Logacheva, M., Penin A., Samigullin T., Vallejo-Roman C., Antonov A. (2007 , “Phylogeny of flowering plants by the chloroplast genome sequences: in search of a “lucky gene”, Biochemistry (Moscow , 72 (12 : 1324-1330. 42. Lu K., Lee H., Liu F., Lo C., Lin J. (2009 ,“Identification of Ginseng Radix
ADN Nested PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism” Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 18, No. 1, P: 58-63
43. Mark Y .S. H.P.D.N. (2008), “Barcode of life’’, Seientific American: 82- 88. 44. Murray M.G., Thompson W.F. (1980 ,“Rapid isolation of high molecular
weight plant DNA” Nucleic Acids Res. Vol. 8(19):4321-4325
45. Nerea Larranaga, José L. Hormaza (2015 “DNA barcoding of perennial fruit tree species of agronomic interest in the genus Annona (Annonaceae)” Front Plant Sci (6): 589
46. Park SU, Kim YK, Lee SY (2009 , “Improved in vitro plant regeneration DNA micropropagation of Rehmannia glutinosa L.”, Journal of Medicial Plants Research, 3(1): 031-034.
47. Preeti S, Deo B, Tiwari S. K. (2013 , “High frequency in vitro multiplication of an endangered medicinal plant Desmodium gangeticum L. (DC ”,Research journal of biotechnology, 8(5): 3-10.
48. San Thandar, Tun O. M (2015 ,“In vitro micropropagation of desmodium triquetrum DC. Myanmar medicinal plan” International Journal of Technical Research ADN Applications e-ISSN, 2320-8163: 133-138.
49. Scharaschklin T., Doyle J.A. (2005 , “Phylogeny ADN historical biogeography of Anaxagorea (Annonaceae) using morphology ADN noncoding chloroplast sequence data”, Syst. Bot. 30: 712–735.
50. Schoch, C.L., Seifert K.A.(2012 , “Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 109 (16): 6241- 6246. 51. Srimara R.S.U, Sreejayn(2010 ,“Assesing species admixtures in raw drug
trade of phyllanthus, a hepatoprotective plant using molecular tools”, Journal of Eth . 130: 208-215.
52. Steinke, D., T, S, Zemlak, J. A. Boutillier & P. D. N. Hebert (2009), “DNA barcoding of pacific Cannada’s fishes” Marine Biology, 156: 2641 - 2647 53. Taberlet P., Eric C., François P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry
V., Gérard C., Christian B., ADN Eske W. (2007 , “Power ADN limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3): 14
54. Van DeWiel C. C. M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J. L., Duistermaat C. H., Smulders (2009 , “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives” Molecular Ecology Resources 9: 1086-1091.
55. Van DeWiel C. C. M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J. L., Duistermaat C. H., Smulders (2009 , “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources 9: 1086-1091.
56. Vasantha M.M, Shivanna K, Manchanahally B (2005 ,“Callus mediated regeneration of Desmodium oojeinense Roxb”, Phytomorphology. An International Journal of Plant Morphology, 55(3): 171-177.
57. Vijayan K. ADN Tsou C. H. (2010 , “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective” Current science 99: 1530 – 1540
58. Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R. (2010 “DNA barcoding of the Lemnaceae a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology 10: 205.
59. Wenpan Dong, Chao Xu1, Changhao Li, Jiahui Sun, Yunjuan Zuo, Shuo Shi, Tao Cheng, Junjie Guo, Shiliang Zhou (2015 . “ycf1, the most promising plastid DNA barcode of land plants” cientific report, 12/2/2015.
60. Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S. D. (2006), “Combining bioinformatics ADN phylogenetics to identify large sets of single- copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary DNA systematic studies: A test case in the euasterid plant clade” Genetics, 174: 1407-1420.
61. Xie H, Li J (2018), Gao H (2009). Total flavone of Desmodium styracifolium relieved apoptosis ADN autophagy of COM-induced HK-2 cells by regulating KIM-1 via p38/MAPK pathway. Mol Cell Biochem,442(1-2):169-175.
62. Xiaohui Pang, Jingyuan Song, Yingjie Zhu, Hongxi Xu, Linfang Huang,
Shilin Chen (2011 , “Applying plant DNA barcodes for Rosaceae species
identification”.Cladistics 27 (2).
63. Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J. (2010 , “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants ADN animals”, PLoS ONE, 5: 13102.