Nội dung 1: Xác định một số trình tự ADN mã vạch để giám định loài Kim tiền thảo;
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu bằng
Javen 8% đến khả năng tạo mẫu sạch Kim tiền thảo;
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST và chất hữu cơ bổ
sung đến khả năng nhân nhanh chồi Kim tiền thảo;
Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ
in vitro;
Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả
năng sống và sinh trưởng của cây Kim tiền thảo ngoài vườn ươm.
2.3. Vật iệu nghiên cứu
2.3.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Loài Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium
- Vật liệu nghiên cứu: Cành Kim tiền thảo.
- Địa điểm lấy mẫu: Trung tâm nghiên cứu và sản xuất thuốc Suối Hai – Ba Vì – Hà Nội của Bệnh viện Y học cổ truyền Bộ Công an.
2.3.2. Thiết bị dụng cụ
- Thiết bị, dụng cụ cho phân tích DNA: cối chày sứ, ống eppendorf các loại, pipetman, ống pancol, đầu côn các loại... Máy móc gồm: bể ổn nhiệt, cân điện tử, máy li tâm lạnh, máy PCR 9700, bể điện di gel agarose nằm ngang, máy soi gel, máy vontex, lò vi sóng, máy chụp ảnh.
- Thiết bị, dụng cụ cho nuôi cấy mô – tế bào: Bếp từ, tủ cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng.
2.3.3. a chất
- Hóa chất dùng trong tách chiết ADN tổng số:
Quá trình tách chiết sử dụng đệm chiết CTAB và một số hóa chất khác như: Dung dịch Chloroform: Isoamylalcohol (24:1) (C:I); 70% ethanol; Isopropanol; H2O deion.
- Hóa chất PCR:sử dụng bộ kít PCR Master Mix của hãng InTRON, Hàn Quốc; H2O deion và các cặp mồi đặc hiệu nhân các đoạn gen ITS, psbA-
trnH , rcbL (Bảng 2.1 .
Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi sử dụng trong đề tài
Gen
đích Tên mồi Trình tự mồi 5’- 3’
Nhiệt độ gắn mồi (oC) Kích thƣớc đoạn gen (bp)
matK matK_F ACCCAGTCCATCTGGAAATCTGGTTC 52 850
matK_R CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG
rbcL
rbcL_F ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
52 600
rbcL_R GTAAAATCAAGTCCACCRCG
ycf1b ycf1b_F TCTCGACGAAAATCAGATTGTTGTGAAT 51 900
ycf1b_R ATACATGTCAAAGTGATGGAAAA
ITS ITS_F ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG 60 800
- Hóa chất tinh sạch sản ph m PCR:sử dụng bộ Kit tinh sạch sản ph m PCR của hãng InTRON, Hàn Quốc.
- Hóa chất điện di, bao gồm:Agarose, hóa chất nhuộm axit nucleic Redsafe, dung dịch đệm điện di TAE 1X, DNA Loading Dye, DNA marker 100bp.
- Các loại hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào : Môi trường MS, 1/2MS, WBM;
Các hóa chất khử trùng mẫu cấy: HgCl2 0,1%;
Các chất điều hòa sinh trưởng nhóm cytokinin: BAP, KIN; Các chất ĐHST nhóm auxin: IBA, -NAA;
Đường sucrose (g ; Agar (g).
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Xác định một số ADN mã vạch để xác định loài cây Kim tiền thảo
2.4.1.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ thực vật.
ADN tổng số từ các mẫu lá được tách chiết theo phương pháp CTAB của Doyle và cộng sự (1990), có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Dung dịch Chloroform: Isoamylalcohol (24:1) (C:I); 70% ethanol; Isopropanol; H2O deion.
Các bƣớc tiến hành tách chiết ADN tổng số nhƣ sau:
Dụng cụ nghiền mẫu: cối chày sứ, ống eppendorf các loại, pipetman, ống pancol, đầu côn các loại… Máy móc gồm: bể ổn nhiệt, cân điện tử, máy li tâm lạnh, máy PCR 9700, bể điện di gel agarose nằm ngang, máy soi gel, máy vontex, lò vi sóng, máy chụp ảnh... (Các dụng cụ đã được hấp khử trùng)
Bước 1: Nghiền 50 mg mẫu (lá, thân, rễ) bằng cối chày sứ và trộn đều có bổ sung 1,0 ml dung dịch đệm CTAB ( Gồm 1,4M NaCl; 1,0M Tris – HCl; 20mM EDTA; 2% CTAB; pH = 8 . Cho dung dịch vào trong ống eppendorf1,5ml.
Bước 2: Ủ ở nhiệt độ 65oC trong 1 giờ, Trong quá trình ủ cứ 15 phút lắc đều 1 lần.
Bước 3: Ly tâm 10.000vòng/phút trong 10 phút.
Bước 4: Hút 500 µl dịch nổi sang ống eppendorf vô trùng khác, bổ sung 500 µl hỗn hợp C:I (choloroform: isoamyl alcolhol) theo tỉ lệ 24:1, lắc mạnh. Ly tâm 13.000vòng/phút trong 10 phút, 4oC.
Bước 5: Chuyển phần dịch nổi sang một ống eppendorf vô trùng khác.Bổ sung 500µl Isopropanol lạnh, lắc đều và ủ ở -200C trong 1 giờ; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút, 4oC, loại bỏ dịch lỏng, thu kết tủa.
Bước 6: Rửa kết tủa bằng cồn 70% 2 lần; để khô tủa ADN ngoài nhiệt độ phòng khoảng 30 phút.
Bước 7: Bổ sung 30µl - 100 µl nước deion để hòa tan tủa ADN và bảo quản lạnh ở - 200
C.
2.4.1.2. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm DNA sau tách chiết
Sản ph m ADN sau tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% trong đệm TE 1X ở hiệu điện thế 80V.
Cách tiến hành:
Pha gel agarose với nồng độ 1%: cân 1g agarose cho vào 100ml dung dịch TAE 1X, đun sôi bằng lò vi sóng cho agarose tan thật đều.
Để hỗn hợp giảm nhiệt độ xuống còn 50-600
C, bổ sung Redsafe, trộn đều và đổ vào khay điện di.
Trước khi đổ bản gel cần lau sạch giấy đổ bằng giấy thấm mềm dễ hút m sau đó cài lược. Lược tạo giếng được đặt ở phía cực âm của bể điện di, tiến hành cân bằng mặt phẳng của giá bể bằng giọt nước sao cho giọt nước ở chính giữa hình tròn trên giá. Đổ gel, chờ agarose đông và tháo lược nhẹ nhàng tránh làm nứt, vỡ giếng.
Đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di, thể tích TAE cần thay đổi sao cho phù hợp để đặt bản gel vào trong bể.
Đặt bản gel vào bể điện di, dung dịch TAE trong bể sao cho bản gel ngập khoảng 1mm so với bề mặt dung dịch điện di.
Lấy 8 ở mỗi mẫu DNA đã được tách chiết và trộn với 2 Dye trên bề mặt giấy parafilm. Cho c n thận hỗn hợp trên vào giếng điện di bằng micropipet. Ghi chép lại thứ tự tra các mẫu DNA vào giếng, chạy điện di ở 80V trong 90 phút. Quan sát sự dịch chuyển của hỗn hợp mẫu.
Sau khi điện di xong, lấy bản gel từ bể soi trực tiếp dưới đèn tia UV.
2.4.1.3. Phương pháp PCR nhân đoạn ADN mã vạch
Thành phần phản ứng PCR (thể tích mỗi phản ứng PCR mỗi mẫu là 20µl) được thể hiện trong bảng 2.2., chu trình nhiệt độ chạy PCR được mô tả như ở bảng 2.3. Bốn cặp mồi đặc hiệu sử dụng để nhân bản bốn trình tự AND mã vạch được mô tả chi tiết trong bảng 2.1.
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (μ ) 1 H2O deion 19 2 2X PCR Master mix 25 3 Mồi xuôi (10µM) 2 4 Mồi ngược (10µM) 2 5 ADN tổng số (20 – 50 ng/ μl 2 Tổng thể tích 50
Bảng 2.3: Chu trình nhiệt độ cho phản ứng PCR
Bƣớc Số chu kì Nhiệt độ (o C) Thời gian Khởi động 1 94 5’ Biến tính 35 94 30s Gắn mồi 51-52oC 30s Kéo dài 72 40s Kết thúc 1 72 5’ Bảo quản 4 ∞
2.4.1.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR và giải tr nh tự
Những sản ph m sau khi dược khuếch đại thành công sẽ được tinh sạch bằng kit Prification Kit do hãng InTRON – Hàn Quốc sản xuất. Các bước tinh sạch như sau:
Bước 1: bổ sung dung dịch đệm BNL (Binding solution vào tối đa 100 hỗn hợp sản ph m PCR theo tỷ lệ 5:1 (1 thể tích sản ph m PCR cần 5 thể tích Binding solution sau đó trộn đều bằng vortex.
Bước 2: Chuyển toàn bộ hỗn hợp thu được từ bước 1 sang cột. Ly tâm với 11000 vòng/phút trong 30 giây. Loại bỏ dung dịch phía dưới cột.
Bước 3: Thêm 750 Washing buffer vào cột lọc. Ly tâm 11000 vòng/phút trong 30 giây. Bỏ dịch phía dưới cột.
Ly tâm lại ở 14000 vòng/phút trong 3 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch và làm khô cột.
Bước 4: Chuyển cột vào ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm 40 Elution buffer vào giữa cột và đặt trên bàn trong 1 phút (chú ý không chạm đầu côn vào màng làm rách màng . Ly tâm trong 1 phút ở 13000 vòng/phút.
Sau khi tinh sạch sản ph m PCR được gửi cho phòng thí nghiệm 1st Base ở Malaysia để giải trình tự. Trình tự nucleotide của đoạn ADN được xác định tại bằng máy giải trình tự, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
2.4.2. Nghiên cứu nhân giống in vitro loài Kim tiền thảo
2.4.2.1. ạo mẫu sạch in vitro Khử trùng ngoài box cấy
Hạt Kim tiền thảo khô được tuyển chọn từ cây đầu dòng.
Lắc rửa mẫu bằng dung dịch xà phòng loãng trong thời gian 10 - 15 phút.
Loại bỏ xà phòng và rửa sạch mẫu cho hết xà phòng.
Tráng lại bằng nước cất 3 lần trước khi tiến hành khử trùng trong box.
Khử trùng trong box cấy
Hóa chất được sử dụng để tạo mẫu sạch gồm: cồn 70%, Javen 8%.
Dùng cồn 70% lắc mẫu hạt trong 1 phút, loại bỏ cồn và tráng mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần.
Lắc mẫu trong Javen 8% với các khoảng thời gian khác nhau. Sau thời gian khử trùng, loại bỏ hết dung dịch Javen 8%, tráng mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần.
Ngâm hạt trong nước cất vô trùng 15 – 20 phút.
Loại bỏ nước cất vô trùng, dùng panh gắp hạt Kim tiền thảo đã khử trùng sạch cấy vào môi trường nuôi cấy khởi đầu: MS + 20 g/l đường saccarose + 6 g/l agar, pH= 5,8.
Thí nghiệm được bố trí với 3 công thức và các thời gian khử trùng khác nhau như bảng 4 dưới đây:
Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm khử trùng vật liệu hạt Kim tiền thảo
CT TN Thời gian khử trùng Javen 8% ( phút ) Tỉ ệ mẫu sạch (%) Tỉ ệ hạt nảy mầm (%) Hình thái cây mầm CT1 5 CT2 7 CT3 9
Theo dõi đánh giá khả năng tạo mẫu sạch và nảy mầm của hạt.
2.4.2.2. Nghi n cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ĐH đến khả năng nhân nhanh chồi
Sau khi thu được chồi Kim tiền thảo sạch từ thí nghiệm 1, chọn những chồi có hình thái mập, xanh để tiến hành nhân nhanh chồi. Cắt đoạn chồi có chứa hai lá mầm từ mẫu sạch cấy vào các môi trường nhân nhanh khác nhau.
Môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường: MS + 30 g/l đường saccharose + 6 g/l agar + chất ĐHST được bố trí theo các công thức khác nhau về loại và hàm lượng của mỗi loại như bảng 5 dưới đây.
Bảng 2.5: Bố trí các thí nghiệm nhân nhanh chồi Kim tiền thảo
CT TN
Chất ĐHST (mg/ ) Số TB/mẫu chồi Tỉ ệ chồi hữu hiệu (%) Chất ƣợng chồi BAP Kinetin NAA
NN1 1 0,3 0,1 NN2 1,5 0,3 0,1 NN3 1 0,3 NN4 1,5 0,3 NN5 1 0,1 NN6 1,5 0,1 ĐC - - -
2.4.2.3. Nghi n cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi
Sau khi xác định được hàm lượng của tổ hợp chất ĐHST thích hợp cho nhân nhanh chồi Kim tiền thảo, tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi Kim tiền thảo. Môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường MS + 6 g/l agar + 30 g/l đường saccarose + chất ĐHST tối ưu ở thí nghiệm 2 + hai chất hữu cơ cơ bản là nước dừa và khoai tây nghiền được thiết kế với hàm lượng khác nhau như bảng 6 dưới đây:
Bảng 2.6: Ảnh hƣởng của hàm ƣợng chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi Kim tiền thảo
CT TN
Chất hữu cơ Số TB/mẫu chồi Tỉ ệ chồi hữu hiệu (%) Chất ƣợng chồi Khoai tây nghiền (g/ ) Nƣớc dừa (ml/l) NC1 0 100 NC2 100 100 NC3 100 0
2.4.2.4. Nghi n cứu ảnh hưởng của chất ĐH đến khả năng ra rễ của Kim tiền thảo.
Chồi Kim tiền thảo hữu hiệu thu được từ thí nghiệm 3 đạt chiều cao từ 1,5 – 2,5 cm sẽ được cấy chuyển sang môi trường kích thích ra rễ MS + 20 g/l đường saccarose + 6 g/l agar, bổ sung chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ khác nhau. Các công thức môi trường được bố trí như bảng 7 dưới đây.
Bảng 2.7: Thiết kế các thí nghiệm ra rễ Kim tiền thảo
CT TN NAA (mg/l) Than hoạt tính (g/l) Tỉ ệ chồi ra rễ (%) Chiều dài rễ trung bình (cm) Số rễ trung bình/ cây (rễ) R1 0,1 0 R2 0,3 0 R3 0,5 0 R4 0,1 1 R5 0,3 1,5 R6 0,5 2
2.4.2.5. Nghi n cứu ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống và sinh trưởng của cây Kim tiền thảo ngoài vườn ươm.
Các cây in vitro hoàn chỉnh đạt tiêu chu n cao 2,5- 3 cm sẽ được huấn luyện cho dần thích nghi với điều kiện môi trường bên ngoài. Thời gian huấn luyện từ 10 -14 ngày, sau đó cây con sẽ được rửa sạch thạch và trồng trên các loại giá thể khác nhau.
Thành phần ruột bầu trồng cây con được bố trí như bảng 8. Đất sử dụng để đóng bầu trong các công thức thí nghiệm là đất tầng B được đập nhỏ, không lẫn đá sỏi hay tạp chất. Cát vàng loại hạt nhỏ đã được sang loại bỏ sỏi, phơi khô.
Sau khi trồng 4 tuần, thống kê các chỉ tiêu để đánh giá tỷ lệ sống và sự sinh trưởng của cây con sau khi trồng ngoài vườn ươm được tổng hợp ở bảng dưới đây.
Bảng 2.8: Ảnh hƣởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống và sinh trƣởng của cây
CT TN Thành phần giá thể ruột bầu Tỷ ệ sống (%) Chiều cao cây TB (cm) Chất ƣợng cây con RB1 Đất tầng B RB2 25% cát + 75% đất RB3 50% cát + 50% đất RB4 75% cát +25% đất RB5 100% cát
Chế độ chăm sóc cây con trong giá thể: Tưới nước phun sương 2 lần/ngày, duy trì độ m cho giá thể từ 70 – 80%.
2.5. Phƣơng pháp thu thập và xử lí số liệu
2.5.1. Phương pháp thu thập số liệu
Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm nhân nhanh chồi:
Tỷ lệ mẫu sạch (% = x 100 Tỷ lệ hạt nảy mầm (% = x 100 Số chồi TB/ mẫu =
Tỷ lệ chồi hữu hiệu (% =
x 100
Tỷ lệ ra rễ (% =
x100
Đặc điểm chồi: màu sắc, kích thước, to hay bé
Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm rễ
Tỷ lệ chồi ra rễ (% =
x 100
Số rễ trung bình =
Chiều dài rễ trung bình =
Đặc điểm của rễ: hình dạng, màu sắc, rễ phụ.
Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm huấn luyện cây con
Tỷ lệ cây sống (% =
x100
Đặc điểm của cây: khỏe hay yếu, màu sắc lá, kích thước,...
Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm ảnh hưởng của thành phần ruột bầu
Tỷ lệ cây sống (%
Độ vượt (cm = chiều cao cây sau – chiều cao cây khi trồng
Số rễ TB/cây
Đặc điểm cây con: hình dạng , màu sắc
Số liệu được thu thập bằng phương pháp thống kê
2.5.2. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu thống kê bằng phần mềm SPSS, Excel.
Các trình tự nucleotide được phân tích và xử lý bằng phần mềm tin sinh BioEdit, Mega7, và các công cụ trên NCBI.
2.5.3. Địa điểm và thời gian bố trí thí nghiệm
- Các thí nghiệm được tiến hành tại Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp; - Thời gian tiến hành thí nghiệm: 01/2019 – 05/2020
Chƣơng 3.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định một số trình tự ADN mã vạch cho oài Kim tiền thảo
3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số
Tách chiết ADN là một bước khởi đầu rất quan trọng, nó quyết định sự thành công cho phản ứng PCR về sau. Để tách chiết ADN đạt hiệu suất và độ tinh sạch cao thì cần lựa chọn một phương pháp tách chiết phù hợp với đối tượng nghiên cứu.
Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ các mẫu lá được tách theo phương pháp tách chiết ADN của Shagai maroof (1994) có cải tiến cho phù hợp với tách chiết ADN của Kim tiền thảo.
Sau khi tiến hành tách chiết, ADN tổng số được điện di trên gel Agarose 1% để kiểm tra chất lượngvà thu được kết quả như hình 3.1.
Hình 3.1: Kết quả tách chiết ADN tổng số từ mẫu á Kim tiền thảo