Xử lý số liệu thống kê bằng phần mềm SPSS, Excel.
Các trình tự nucleotide được phân tích và xử lý bằng phần mềm tin sinh BioEdit, Mega7, và các công cụ trên NCBI.
2.5.3. Địa điểm và thời gian bố trí thí nghiệm
- Các thí nghiệm được tiến hành tại Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp; - Thời gian tiến hành thí nghiệm: 01/2019 – 05/2020
Chƣơng 3.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định một số trình tự ADN mã vạch cho oài Kim tiền thảo
3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số
Tách chiết ADN là một bước khởi đầu rất quan trọng, nó quyết định sự thành công cho phản ứng PCR về sau. Để tách chiết ADN đạt hiệu suất và độ tinh sạch cao thì cần lựa chọn một phương pháp tách chiết phù hợp với đối tượng nghiên cứu.
Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ các mẫu lá được tách theo phương pháp tách chiết ADN của Shagai maroof (1994) có cải tiến cho phù hợp với tách chiết ADN của Kim tiền thảo.
Sau khi tiến hành tách chiết, ADN tổng số được điện di trên gel Agarose 1% để kiểm tra chất lượngvà thu được kết quả như hình 3.1.
Hình 3.1: Kết quả tách chiết ADN tổng số từ mẫu á Kim tiền thảo
Giếng 1: Mẫu K 1 giếng 2: mẫu K 2 giếng 3: mẫu K 3 giếng 4: mẫu KTTi (in vitro)
Kết quả điện di cho thấy các băng vạch ADN tổng số sáng nét, chứng tỏ ADN tổng số tách chiết được từ 04 mẫu lá Kim tiền thảo tương đối đồng đều, chất lượng ADN tương đối tốt. Vì thế cả 4 mẫu ADN này được sử dụng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR nhân bản các đoạn trình tự ADN mã vạch sử dụng trong nghiên cứu.
3.1.2. Kết quả nhân bản trình tự ADN mã vạch cho loài Kim tiền thảo
Các trình tự ADN mã vạch đã được sử dụng rất phổ biến để giám định các loài sinh vật, bao gồm cả thực vật, động vật và vi sinh vật. Đối với loài Kim tiền thảo, một số trình tự ADN mã vạch đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế, ví dụ như trình tự gen matK, trnH-psbA, rbcL, ITS1, ITS2,...
Hình 3.2: Kết quả điện di sản ph m PCR các đoạn trình tự ADN m vạch
(A): sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen matK, (B): sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen rbcL (C): sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen I (D): sản phẩm PCR nhân
bản đoạn gen ycf1b. Giếng 1-4: các mẫu K 1 K 2 K 3 và K i ĐC: đối chứng âm (ADN được thay thế b ng H2O deion), M: ADN marker 100bp.
Từ 4 mẫu ADN tổng số đã tách được, sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho từng đoạn để tiến hành phản ứng PCR nhân bản các đoạn ADN. Tiến hành nhân bản 4 đoạn gen matK, ITS,rcbL, ycf1b từ 4 mẫu ADN tổng số của Kim tiền thào bằng phản ứng PCR với các cặp mồi tương ứng lần lượt là:
matK_F/R, rcbL_F/R, ITS_F/R, ycf1b_F/R. Thực hiện phản ứng PCR lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu thí nghiệm. Sản ph m PCR của tất cả các mẫu thí nghiệm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%
Gen matK là trình tự gen nằm trong lục lạp có thể nhân bản một cách dễ dàng ở nhiều loài thực vật. Trình tự gen matK đã được sử dụng rộng rãi để
xây dựng mối quan hệ các hệ sinh thái giữa các loài có liên quan chặt chẽ hoặc để định danh các loài thực vật.
Cặp mồi sử dụng là matK_F và matK_R để nhân bản đoạn gen matK. Kết quả kiểm tra sản ph m điện di gen matK trên gel agarose 1% cho thấy gen matK được khuếch đại tốt ở cả 04 mẫu Kim tiền thảo, các băng thu được sáng đều với kích thước tương tự nhau >800 bp (khi so sánh với thang ADN chu n 100 bp), không có băng phụ xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu (Hình 3.2 A . Do đó, có thể khẳng định đã nhân bản thành công đoạn gen matK ở loài Xá xị với kích thước trên 800bp và sản ph m nhân bản của đoạn gen matK sẽ được tinh sạch và giải trình tự nucleotide. Trình tự đoạn gen matK đã được nhân bản ở 07 mẫu Xá xị tại Hòa Bình và Quảng Ninh có kích thước khoảng >800bp so với đoạn trình tự gen matK được nhân bản ở cây Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis (Hà Văn Huân và cộng sự, 2015 có kích thước được nhân bản ở đoạn gen nhân là 951bp thì có số nucleotide ít hơn. Tác giả sử dụng cặp mồi để nhân bản đoạn gen matK với trình tự mồi xuôi: 5’-TCCATGGG TTTATATGGATCCTTCCTGGTT-3’ và mồi ngược: 5’-CCCG CCATGGATG GAAGAATTCAAAAGATA-3’, trình tự cặp mồi này khác với trình tự cặp mồi được sử dụng trong đề tài. Qua đó có thể thấy, tuy cùng là gen
matK nhưng mỗi tác giả lại sử dụng một cặp mồi để nhân bản các đoạn trình tự khác nhau, do đó sẽ cho ra sản ph m PCR có kích thước khác nhau.
Gen rbcL là một trong những gen mã hóa những yếu tố thuộc hệ thống quang hợp (rubisco , là gen đầu tiên dùng để giải trình tự thực vật và được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên khả năng phân biệt loài rất thấp. Trong quá trình tìm hiểu về một số trình tự AND mã vạch của cây Kim tiền thảo, đã có một số trình tự đã được công bố trên ngân hàng gen có sử dụng đoạn trình tự đoạn gen rbcL, cho nên chúng tôi đã sử dụng đoạn trình tự này trong nghiên cứu của mình. Sử dụng cặp mồi là rbcL_F và rbcL_R để nhân bản đoạn gen rbcL.
Kết quả kiểm tra sản ph m điện di gen rbcLtrên gel agarose 1% cho thấy gen
rbcL được khuếch đại tốt ở cả 04 mẫu Kim tiền thảo, các băng thu được sáng đều với kích thước tương tự nhau khoảng 600 bp (khi so sánh với thang ADN
chu n 100 bp) (Hình 3.2 B .Từ kết quả thu được cho thấy đã nhân bản thành công đoạn gen rbcL ở loài Xá xị và sản ph m PCR có hàm lượng cao. Các sản ph m PCR này sẽ được tinh sạch và giải trình tự nucleotide. Nghiên cứu sử dụng cặp mồi có cùng trình tự để nhân bản đoạn gen rbcL ở loài Lan Kim tuyến cho kết quả tương tự như ở loài Kim tiền thảo nghiên cứu. Kích thước đoạn gen nhân bản đều khoảng 600bp (Lê Công Mạnh, 2019 . Tác giả đã sử dụng cặp mồi để nhân bản gen rbcL với trình tự mồi xuôi: 5’- ATGTCACCACAAACAGAGACTAAA GC-3’ và trình tự mồi ngược: 5’- GTAAAATCAAGTCCACCTCG-3’, đoạn trình tự giống với đoạn trình tự dùng để nhân bản đoạn trình tự đoạn gen rbcL. Từ so sánh này nhận thấy kích thước gen rbcL khá bảo thủ ở các loài khác nhau, khi sử dụng cùng một cặp mồi thì sẽ nhân bản được các đoạn trình tự có kích thước tương tự nhau. Tuy nhiên, các đoạn rbcL nhân bản ở các loài khác nhau có thể sai khác về trình tự nucleotide và chỉ có thể khẳng định sau khi giải trình tự nucleotide của các đoạn gen.
Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm ADN mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers) nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S. Vùng ITS vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi.Kết quả nhân bản đoạn gen ITS ở 04 mẫu Kim tiền thảo được thể hiện trên hình 3.2C. đoạn gen ITS khuếch đại thành công ở tất cả 04 mẫu Kim tiền thảo. Các mẫu đều xuất hiện một băng ADN sáng rõ nét, không có băng ADN phụ xuất hiện, kích thước khoảng trên 800bp phù hợp với kích thước lý thuyết của đoạn gen ITS dự kiến nhân bản. Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy ở lần PCR thứ 2 và thứ 3. Kết quả này một lần nữa khẳng định sản ph m PCR nhân bản đoạn gen ITS rất đặc hiệu, có thể sử dụng trực tiếp sản ph m này để xác định trình tự nucleotide. Tác giả Lê Thanh Hương và cộng sự (2017 cũng sử dụng cặp mồi
ITS F/R có trình tự giống với trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này nhưng trên một số đối tượng thuộc chi Nhân sâm cho thấy đoạn gen ITS ở chi Nhân sâm cũng có kích thước 800 bp. Kết quả này tương tự như kết quả nhân bản đoạn ở 04 mẫu Kim tiền thảo. Điều này thể hiện rằng kích thước đoạn là
bảo thủ ở các loài thực vật khác nhau khi cùng sử dụng một cặp mồi để nhân bản. Tuy nhiên kết quả này chỉ giống nhau về kích thước, còn để khẳng định về sự đa dạng của trình tự nucleotide thì cần giải trình tự đoạn gen và phân tích so sánh.
Ycf1 là một gen lớn thứ hai nằm trong hệ gen lục lạp của thực vật, gen này có kích thước khá lớn (5709 bp ở cây thuốc lá . Hai trình tự trong gen
ycf1 là ycf1a và ycf1b được cho là có mức độ đa dạng về nucleotide cao nhất ở mức độ loài trong hệ gen lục lạp của thực vật hạt kín (Wenpan Dong và cộng sự, 2015 . Do đó, ycf1 được xem như một chỉ thị ADN mã vạch có giá trị trong nghiên cứu phân loại thực vật bằng chỉ thị phân tử. Trong nghiên cứu này, cặp mồi ycf1b F/R được sử dụng để nhân bản một đoạn trình tự có kích thước khoảng 900bp trong vùng ycf1b của gen ycf1. Kết quả PCR cho thấy một băng ADN duy nhất ở cả 04 mẫu nghiên cứu, các băng ADN có kích thước giống nhau và đều khoảng 900bp như dự kiến (Hình 3.2 D . Sản ph m PCR nhân bản đoạn trình tự ycf1b sẽ được tinh sạch và giải trình tự nucleotide để xác định chính xác chiều dài đoạn gen nhân bản cũng như trình tự nucleotide cụ thể ở từng mẫu Kim tiền thảo.
3.1.3. Kết quả giải trình tự và so sánh trình tự các đoạn ADN mã vạch
Với tổng số 04 mẫu Kim tiền thảo cùng ba lần lặp lại ở mỗi mẫu, tổng cộng thu được 12 trình tự nucleotide cho một đoạn mã vạch ADN đề xuất. Chất lượng trình tự nucleotide là cao ở tất cả các mẫu, tỷ lệ giải trình tự nucleotide thành công là 100%. Các trình tự này sau đó được xử lý và phân tích sử dụng phần mềm BioEdit version 7.2.5. Kết quả phân tích trình tự nucleotide của 4 chỉ thì ADN mã vạch matK, rbcL, ITS, và ycf1b có kích thước tương ứng là 864 bp, 575 bp, 852 bp, và 920 bp. Trình tự nucleotide của 04 mẫu Kim tiền thảo đối với từng chỉ thị ADN mã vạch được so sánh với nhau bằng phần mềm BioEdit V7.2.5. Tiếp theo, trình tự nucleotide của từng đoạn ADN mã vạch được so sánh trực tiếp với các trình tự tương đồng trên ngân hàng gen NCBI sử dụng công cụ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Từ kết quả so sánh trình tự nucleotide tương đồng, cây quan hệ di truyền giữa mẫu Kim tiền thảo
nghiên cứu với các loài cùng thuộc chi Desmodium và một số loài có quan hệ gần sẽ được thiết lập để thấy rõ về khả năng định danh loài Kim tiền thảo của từng chỉ thị AND mã vạch sử dụng trong nghiên cứu.
3.1.3.1. Đoạn tr nh tự MatK
Trình tự đoạn gen matK nhân bản được ở 04 mẫu Kim tiền thảo có kích thước bằng nhau và bằng 864 bp. Tất cả 04 mẫu đều có độ tương đồng về đoạn trình tự matK là 100%. Do đó, mẫu KTT2 được lựa chọn làm mẫu đại diện cho tất cả 04 mẫu Kim tiền thảo. Trình tự nucleotide của đoạn trình tự matK ở loài Kim tiền thảo được thể hiện trên hình 3.3. Từ sự tương đồng 100% về trình tự đoạn gen matK cho thấy các mẫu Kim tiền thảo nghiên cứu không có sự đa hình về trình tự.
Hình 3.4: Kết quả so sánh trình tự nuc eotide đoạn gen matK của mẫu Kim tiền thảo (query) với oài Desmodium styracifolium trên NCBI (sbjct)
Kết quả này có thể là do các mẫu Kim tiền thảo đều được lấy từ một xuất xứ là Ba Vì, kể cả mẫu Kim tiền thảo nuôi cấy in vitro (KTTi cũng được lấy mẫu từ Trung tâm nghiên cứu và sản xuất thuốc Suối Hai – Ba Vì.
Sử dụng trình tự đoạn gen matK của các mẫu Kim tiền thảo để so sánh với các trình tự tương đồng trên ngân hàng gen quốc tế NCBI cho thấy mẫu KKT2 tương đồng 99,53% với loài Kim tiền thảo có tên khoa học là
Desmodium styracifolium (NC_046791.1, MN913536.1 và tương đồng 98,47% đến 99,18% với ba loài cùng thuộc chi Desmodium (MK933632.1, EU717420.1, LC080896.1), tương đồng 98,47% với loài thuộc chi khác trong họ Đậu là Uraria lagopodoides (KF621107.1 . Kết quả so sánh trình tự đoạn gen matK của mẫu KTT2 với loài Desmodium styracifolium được thể hiện trên hình 3.4 và danh sách các loài tương đồng được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Các trình tự đoạn gen matK tƣơng ứng với tên oài tƣơng đồng với đoạn trình tự matK của mẫu Kim tiền thảo
Stt Tên oài M số trên NCBI Tỷ ệ tƣơng đồng
1 Desmodium styracifolium NC_046791.1 99,53% 2 Desmodium styracifolium MN913536.1 99,53% 3 Desmodium heterocarpon MK933632.1 99,18%
4 Desmodium barbatum EU717420.1 98,71%
5 Desmodium oblongun LC080896.1 98,47%
6 Uraria lagopodoides KF621107.1 98,47%
Từ kết quả so sánh trình tự của mẫu KTT2 với 06 loài trên ngân hàng NCBI, cây quan hệ di truyền giữa các mẫu trên được xây dựng và kết quả thể hiện trên hình 3.5. Mẫu Kim tiền thảo nghiên cứu có quan hệ di truyền gần nhất với loài Desmodium styracifolium, sau đó đến loài
Desmodium heterocarpon. Hai loài Desmodium barbatum và Desmodium oblongun được xếp cùng nhóm với loài raria lagopodoides trong đ
0. Tất cả 06 loài tương đồng cao với mẫu Kim tiền thảo đều thuộc họ Đậu, do đó kết quả phân tích trình tự và cây quan hệ di truyền là có độ tin cậy. Kết quả này có thể khẳng định sử dụng đoạn trình tự matK hoàn toàn có thể định danh được loài Kim tiền thảo.
Hình 3.5: Cây quan hệ di truyền giữa mẫu Kim tiền thảo với các trình tự tƣơng đồng trên ngân hàng gen quốc tế NCBI
3.1.3.2. Đoạn tr nh tự rbcL
Kết quả giải trình tự nucleotide thu được một đoạn trình tự rbcL có kích thước 575 bp. Và đoạn trình tự này được sử dụng để phân tích và so sánh với các trình tự tương đồng trên ngân hàng gen NCBI. Kết quả trình tự nucleotide của đoạn gen rbcL ở 04 mẫuKim tiền thảo được thể hiện trên hình 3.6.
Trình tự nucleotide của đoạn gen rbcL tương đồng 100% đối với tất cả 04 mẫu Kim tiền thảo nghiên cứu, do đó mẫu Kim tiền thảo KTT2 được chọn làm mẫu đại diện cho cả 04 mẫu. Kết quả này cho thấy các mẫu Kim tiền thảo không có sự đa hình về trình tự đoạn gen rbcL. Đây là kết quả hoàn toàn có thể tin cậy được vì vùng rbcL được xem là vùng khá bảo thủ giữa các loài nên trong một loài thì chúng lại càng giống nhau.
Sử dụng công cụ BLAST trên NCBI để so sánh trình tự đoạn gen rbcL của mẫu KTT2 với các trình tự tương đồng trên ngân hàng gen cho thấy mẫu KTT2 tương đồng 98,60% với loài Kim tiền thảo có tên khoa học là
06 loài có độ tương đồng về trình tự đoạn gen rbcL cao nhất với mẫu KTT2, chúng tôi xây dựng cây quan hệ di truyền giữa 07 mẫu như hình 3.7.
Hình 3.6: Trình tự nuc eotide đoạn gen rbcL của các mẫu Kim tiền thảo
Kết quả phân tích cây quan hệ di truyền giữa mẫu KTT2 và 06 loài tương đồng thuộc chi Desmodiumdựa trên trình tự đoạn gen rbcLcho thấy mẫu KTT2 có quan hệ gần gũi nhất với loài Kim tiền thảo có tên khoa học là
Desmodium styracifolium. Tuy độ tương đồng giữa trình tự đoạn rbcL của mẫu KTT2 với loài Desmodium styracifolium không đạt 100%, nhưng cũng thể hiện mối quan hệ di truyền rất gần (tỷ lệ tương đồng cao nhất trong các loài cùng chi). Kết quả này có thể khẳng định loài Kim tiền thảo nghiên cứu có tên khoa học là Desmodium styracifolium khi sử dụng chỉ thị ADN mã vạch là đoạn trình tự rbcL. Giám định bằng hình thái các mẫu Kim tiền thảo cũng bước đầu khẳng định đó là loài Desmodium styracifolium, tuy nhiên phương pháp ADN mã vạch một lần nữa có thể kiểm định cho kết quả giám định này. Việc sử dụng các chỉ thị phân tử để định danh loài nói chung và thực vật nói riêng đã