Khái niệm: Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là lĩnh vực nuôi cấy các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [9].
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào của nhà sinh lý thực vật người Đức
Haberl vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20: “Mọi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (ADN) cần thiết và đủ của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”. Ngày nay các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ.
Trong nuôi cấy in vitro, quá trình phát sinh hình thái thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau. Khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ auxin (đại diện là IAA)/cytokinin (đại diện là kinetin) thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, khi tỷ lệ này cao mô nuôi cấy sẽ phát sinh hình thái theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo (callus) [7].
1.3.2. Các bước tiến hành của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật
Giai đoạn chuẩn bị
Là bước đầu tiên của quy trình nhân giống. Giai đoạn này gồm các khâu như: chọn lọc cây mẹ để lấy mẫu, chọn cơ quan để lấy mẫu. Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Sau đó chọn chế độ khử trùng thích hợp làm sao để mẫu cấy bị nhiễm là thấp nhất, đồng thời khả năng sinh trưởng và phát triển vẫn tốt. Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các tác nhân hoá học có tính sát trùng mạnh như cồn 70%, HgCl2,
NaOCl, Ca(ClO3)2, H2O2,... để khử trùng mẫu. Nồng độ chất khử trùng được chọn trên cơ sở thực tiễn thí nghiệm, theo nguyên tắc mô non nồng độ thấp, mô già nồng độ cao, có nhiều trường hợp phải phối hợp hai hay nhiều chất khử trùng với nhau. Cũng có thể bổ sung các chất kháng nấm và vi khuẩn vào môi trường nhằm tăng hiệu quả khử trùng. Thời gian khử trùng được xác định bằng thực nghiệm đối với từng loài cây hoặc mô nuôi cấy. Nhìn chung, mô non khử trùng trong thời gian ngắn, mô già trong thời gian dài hơn.
Giai đoạn nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn ta đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo thích hợp để tái sinh mô cấy. Môi trường này được xác lập cho từng loại cây, loại mô nuôi cấy. Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus sẽ được lưu giữ ở phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy ban đầu sẽ xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính. Đây sẽ là những vật liệu khởi đầu để cho quá trình nhân nhanh tiếp sau đó.
Giai đoạn nhân nhanh
Một khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi, các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn nhân nhanh. Người ta cần thu được tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường đã được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu này. Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường kéo dài trong khoảng 1 - 2 tháng tùy mỗi loại cây và nhìn chung cho cả giai đoạn nhân nhanh là vào khoảng 10 - 36 tháng.
Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ, ở giai đoạn này phải tạo cây trong ống nghiệm phát triển cân
đối về thân, lá, rễ để đạt tiêu chuẩn của một cây giống.
Giai đoạn vườn ươm.
Đây là giai đoạn đánh giá tính hiện thực của quá trình nhân giống in vitro khi chuyển cây từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên. Khi đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm, nhằm giảm đi hiện tượng “sốc” do thay đổi về điều kiện môi trường cần có giai đoạn thích nghi. Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu sự chăm sóc đặc biệt, do đó ở giai đoạn này cần chủ động để điều khiển được quá trình chiếu sáng, dinh dưỡng và giữ nước cũng như lựa chọn các giá thể thích hợp và trong điều kiện cách ly bệnh để các cây con đạt tỷ lệ sống cao.
1.3.3. Thành tựu trong nuôi cây mô đối với chi Dendrobium
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trở thành một trong những phương thức quan trọng để nhân nhanh, đặc biệt là đối với những cây khó nhân nhanh bằng phương pháp truyền thống. Đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng thành công trong việc nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen thực vật
1.3.3.1.Nghiên cứu trong nước:
Nguyễn Thị Lài và cộng sự (2018) đã nghiên cứu nhân giống thành công Lan Hoàng Thảo Nghệ Tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe) được kết quả như sau: Nguyên liệu ban đầu là lát cắt mỏng theo chiều ngang (tTCL - traverse thin cell layer) của chồi invitro. Kết quả cho thấy, môi trường gây hiệu ứng tối ưu để sản sinh protocorm - like bodies là môi trường VW + 20 g/L sucrose + 10% nước dừa + 7g/L aga + 1,5mg/L BAP (tạo ra 30,1 protocorm - like bodies/lát mỏng sau sáu tuần nuôi cấy). Cụm protocorm - like bodies được cấy lên môi trường VW + 20 g/L sucrose + 10% nước dừa + 7 g/L agar + 1,0 g/L than hoạt tính + 2g/L peptone + 1,5 mg/L BAP + 0,5 mg/L BAP + 30 g/L dịch nghiền bí ngô + 1g/L tảo spirulina cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất, đạt 16,82 chồi/ mẫu sau 8 tuần nuôi cấy. Môi trường cấy chồi in vitro để tạo cây con hoàn chỉnh VW + 20 g/L sucrose + 10% nước dừa + 7 g/L agar +
1,0 g/L than hoạt tính + 1,0 mg/L BAP là thích hợp nhất với số rễ được hình thành là 7,3 rễ/cây sau 6 tuần nuôi cấy [8].
Nguyễn Văn Việt (2017) đã nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro
thành công trong vi nhân giống lan Hoàng Thảo kèn (Dendrobium lituiflorum Lindley) thu được kết quả sau: Sát khuẩn bề mặt quả lan bằng etanol 70% trong 1 phút, khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 12 phút và nuôi cấy trên môi trường Knops, cho tỷ lệ lên mẫu sạch là 86,7%, tỷ lệ mẫu phát sinh thể chồi (protocom) là 76,7%, với thời gian phát sinh chồi 5 tuần. Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường BAP 0,8 mg/mL, Kinetin 0,3 mg/ml, NAA 0,1 mg/mL, dịch chiết khoai tây 100mg/L, nước dừa 100mg/L, sucrose 30mg/L, aga 5g/L cho hệ số nhân chồi cao nhất 10,3 sau 5 tuần nuôi cấy. Chồi ra rễ 100% với số rễ trung bình 3,6cm khi nuôi trên môi trường Knops bổ sung IBA 0,2 mg/L, NAA 0,3 mg/L, dịch chiết khoai tây 100ml/L, sucrose 20mg/L sau 5 tuần nuôi cấy. Cây con hoàn chỉnh được huấn luyện và chuyển ra trồng trên giá thể dớn trắng, xử lý giá thể 2 ngày trong nước, cho tỷ lệ sống 89% [35].
Vũ Kim Dung và cộng sự (2016) đã xây dựng thành công quy trình nhân giống lan Hoàng Thảo Ý thảo ba màu (Dendrobium gratiosissimun
Reichenb.f) bằng kỹ thuật invitro kết quả nghiên cứu cho thấy: Sát khuẩn bề mặt quả lan bằng ethanol 70% trong 2 phút, khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút và nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung sucrose 30g/L cho tỷ lệ mẫu sạch là 96,67% tỷ lệ mẫu phát sinh protocom 90% với thời gian phát sinh chồi 20 ngày. Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường BAP 0,5 mg/L, NAA 0,3 mg/L, Kinetin 0,3 mg/L, dịch chiết khoai tây 100mg/L, nước dừa 100mg/L, sucrose 30g/L, cho hệ số nhân chồi và tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất (9,53 và 96,67%) sau 4 tuần nuôi cấy, chồi ra rễ 93,33% và chiều dài rễ trung bình 3,22cm khi nuôi cấy trên môi
trường MS bổ sung IBA 0,2 mg/L, NAA 0,3 mg/L, dịch chiết khoai tây 100mg/L, sucrose 20g/L sau 5 tuần nuôi cấy [4].
Nguyễn Quỳnh Trang và cộng sự (2013) đã xây dựng thành công quy trình tạo cây con bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro lan phi điệp tím (Dendrobium anosmum) từ nguồn vật liệu ban đầu là quả lan phi điệp tím được kết quả như sau: Quả lan được khử trùng bề mặt bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút và khử trùng bằng NaOCl 5% trong 15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch đạt và tỷ lệ mẫu sạch tái sinh cao nhất. Môi trường Knuds có bổ sung 0,3 mg/L NAA + 0,3 mg/L BAP cho hệ số nhân nhanh thể chồi đạt 5,8 lần/3 tuần, chất lượng thể chồi tốt. Sau 4 tuần , công thức bổ sung 30g/L sucrose + 0,5 mg/L GA3 + 0,1 mg/L Kinetin chồi tăng trưởng tốt nhất (2,45 cm), chất lượng chồi tốt. Khi cây có chiều cao > 4cm, có 3-4 rễ ta đem bình cây ra huấn luyện ở điều kiện tự nhiên 1 tuần, rửa sạch thạch, đưa cây ra trồng trên giá thể [12].
Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013) đã nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan bản địa Dendronium nobile lindley (Thạch Hộc) và đưa ra kết luận: Nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi, môi trường gieo hạt là MS + (100ml nước dừa + 10g sucrose + 6,0g aga)/lít môi trường [1].
Nguyễn Thị Lý Sơn và cộng sự (2014) đã xây dựng môi trường nhân giống in vitro lan Dendrobium officinle Kimura et Migo (Thạch Hộc Thiết Bì) kết quả chỉ ra như sau: Nhân giống bằng gieo hạt trên môi trường (VW + 10g sucrose +6g aga + 100ml nước dừa)/ lít môi trường, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường (MS + 100ml nước dừa + 20g sucrose + 6g aga + 60g chuối chín)/lít môi trường. Nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ sử dụng đoạn thân invitro mang 2 mắt ngủ và nuôi cấy trên môi trường (MS + 10% nước dừa + 20g sucrose + 6g aga + 0,5mg/L BA + 0,5 mg/L NAA)/lít môi trường [2].
1.3.3.2. Nghiên cứu trên thế giới:
Nararatn Wattanapan và cộng sự (2018) đã xây dựng quy trình nhân giống lan Paphiopedilum callosum var. sublaeve (họ phong lan) bằng lát cắt mỏng ngang (tTCL) được rút ra kết luận sau: Nuôi cấy hạt giống 2 tuần trong nước cất trước khi chuyển sang môi trường MS là điều kiện tối ưu để thúc đẩy hạt nảy mầm trong ống nghiệm. Các lớp tế bào mỏng ngang (tTCL) được nuôi cấy trên môi trường rắn MVW chứa 1,0 mg/L TDZ trong 8 tuần cung cấp protocorm - like bodies (PLBs) được tái sinh cao nhất (30,00 ± 6,67), sự hình thành chồi (40,00 ± 5,16), sự hình thành rễ (30,00 ±12,38), và tỷ lệ sống (70,00 ± 4,47). Các cây trồng thích nghi trong nhà kính tăng trưởng tốt với tỷ lệ sống 80%.
Riva S.S và cộng sự (2016) đã nghiên cứu quy trình tái sinh và nhân nhanh invitro của Dendrobium bensoniae được kết luận như sau: Tái sinh trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/L BAP là tốt nhất, tốt hơn nồng độ khác của BAP và BAP + IBA trong nghiên cứu. Số lượng chồi và lá cao nhất tại 1,0 mg/L BAP + 1,5 mg/L IBA được bổ sung vào môi trường MS. Đối với rễ 0,5 mg/L BAP + 1,0 mg/L IBA được tìm thấy là hiệu quả nhất. Các cây con có rễ tốt đã được thích nghi thành công dưới độ ẩm 70% - 80%. Sau khoảng thời gian trồng, có 85% cây con sống sót.
Maridass M và cộng sự (2010) đã xây dựng quy trình nhân giống in vitro Dendrobium nanum Hook. F từ chồi thân rễ thu được kết quả sau: Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo tối đa thu được trên môi trường MS với 2,0 µM/L NAA và 1,2 µM/L kinetin. Hiệu quả tối đa của cảm ứng chồi (15,78 ± 0,37mm) được quan sát thấy trên môi trường cơ bản được bổ sung 0,5 µM/L BAP. Khi đưa ra môi trường sống tự nhiên chúng có 85% tỷ lệ sống sau 3 tháng.
Chương 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU