a.Các bước tiến hành phản ứng PCR
Thể tích mỗi phản ứng PCR mỗi mẫu là 50 µL.
Bảng 2.4. Trình tự và thông tin của các cặp mồi được sử dụng
Vùng gen Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ gắn mồi (Ta) ycf mP3 F 5’- TTCCATGGCCTTCTTTGCATTTGTTGC-3’ 500 C mP3R 5’- TTCCATGGTTTTTTGAGGATCCGCTGT- 3’ rbcL rP2F 5’- TGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’ 500 C rP2R 5’- GTAAAATCAAGTCCACCTCG -3’ trnH- psbA trnPF1 5’- GTTATGCATGAACGTAATGCTC -3’ 510 C psbPR1 5’- CGCGCATGGTGGATTCACAATCC -3’
ITS2 Is2P1F 5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’ 500 C
Is2P1R 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
Các bước tiến hành:
- Bước 1: Cho các thành phần phản ứng PCR vào ống PCR. Thực hiện ở nhiệt độ thấp (trong đá). Bảng 2.5. Thành phần của một phản ứng PCR STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µL) 1 H2O deion 7 2 Master mix 2 X 10 3 Mồi xuôi F 10 pM 1 4 Mồi ngược R 10 pM 1 5 ADN khuôn 1 Tổng thể tích 20
- Bước 2: Trộn (mix) đều hỗn hợp bằng pipet hoặc máy Vortex, sau đó làm lắng (spin) bằng máy ly tâm (8000 vòng/phút, 1 phút).
- Bước 3: Lập chương trình và chạy PCR trên máy.
Chu trình nhiệt: (nhiệt độ gắn mồi thay đổi phụ thuộc mồi)
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, chạy điện di để kiểm tra, so sánh với thang chuẩn marker 1kb.
Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 1%
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, chạy điện di để kiểm tra, so sánh với thang chuẩn marker 1kb.
Pha gel agarose 1%
Cân 1g agarose cho vào 100ml TAE 1X.
Đun nóng bằng lò vi sóng.
Bổ sung 4µl RedSafe/100ml gel, mix đều.
Lắp lược vào bản gel, đổ gel, chờ 20 - 30 phút cho gel đông lại.
Điện di
Tra vào mỗi giếng 2µl sản phẩm PCR.
Chạy điện di trong dung dịch TAE 1X, 90V trong 30 phút.
Soi gel bằng tia UV.
2.4.3.Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PCR purification kit của Norgen. Các bước tinh sạch tiến hành như sau:
- Thêm 5V binding solution vào sản phẩm PCR, mix và ly tâm nhẹ - Lắp cột, chuyển dịch sang cột
- Ly tâm 8000vòng/phút trong 1 phút
- Thêm 500µl wash solution A. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút - Loại bỏ dịch, lắp lại cột
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút để làm khô - Lắp cột vào ống eppendorf
- Bổ sung 50µl elution buffer - Ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đưa đi giải trình tự