2.4.1.Tách chiết DNA tổng số
2.4.1.1.Quy trình tách chiết
Bước 1: Cân 0,2 g mẫu lá cho vào cối chày sứ, bổ sung 600 µl EBA, 1800 µl EBB và 200 µl SDS, nghiền mẫu bằng cối chày sứ để phá vỡ tế bào.
Bước 2: Hút 1,5 µl mẫu cho vào ống eppendorf 1,5 µl sạch.
Bước 3: Ủ mẫu ở 65oC trong bể ổn nhiệt, thời gian 10 phút.
Bước 4: Ly tâm 12.000 v/ p trong 10 phút ở 4oC.
Bước 5: Hút 1,0 µl dung dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5 µl.
Bước 6: Bổ sung 410 µl CH3COOK. Trộn đều, đặt ống trong đá 5 phút.
Bước 7: Ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC để thu dịch nổi.
Bước 8: Thu dịch nổi và bổ sung isopropanol lạnh theo tỷ lệ là Vmẫu : Visopropanol = 1:1, đảo nhẹ và ủ ở -20oC trong 20 phút.
Bước 9: Ly tâm thu tủa 12.000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch nổi, thu tủa.
Bước 10: Rửa tủa bằng 500 µl ethanol 70% (cồn 70% để rửa các cặn bẩn kết tủa cùng DNA).
Bước 11: Ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 phút ở 4oC, loại bỏ dịch nổi rồi làm khô tủa (ít nhất 30 phút).
Bước 12: Hòa tan tủa trong 100 µl đệm Elution.
Bước 13: Kiểm tra DNA thu được bằng điện di trên gel agarose 1% có chứa RedSafe, trong đệm TAE 1X, hiệu điện thế 90V và được so sánh với
thang chuẩn maker 1kb để kiểm tra chất lượng.
Bước 14: Bảo quản mẫu ở -20oC.
2.4.1.2. Kiểm tra kết quả tách chiết ADN tổng số
Sản phẩm ADN sau khi tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, trong đệm TAE ở hiệu điện thế 90V.
Cách tiến hành:
Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 1g agarose cho vào 100ml dung dịch TAE 1X. Đun sôi bằng lò vi sóng cho agarose tan thật đều.
Để hỗn hợp giảm nhiệt độ xuống còn 50 - 600C bổ sung Redsafe với tỷ lệ 5 µL Redsafe/100 mL gel agarose 1%. Trộn đều và đổ vào khay điện di.
Trước khi đổ bản gel cần lau sạch giá đổ bằng giấy thấm mềm dễ hút nước, sau đó mới cài lược. Lược tạo giếng được đặt ở phía cực âm của bể điện di. Tiến hành cân bằng mặt phẳng của giá bể bằng giọt nước trên giá. Đổ gel, chờ agarose đông và tháo lược.
Đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di, dung tích TAE có thể linh động thay đổi để phù hợp khi đặt bản gel trong bể.
Đặt bản gel vào bể điện di, lưu ý có thể thêm hay bớt dung dịch TAE 1X để được bản gel ngập khoảng 1mm so với bề mặt dung dịch điện di.
Lấy 5 µl ở các mẫu ADN đã tách chiết được trộn với 2 µL Dye trên bề mặt giấy parafilm. Cho cẩn thẩn hỗn hợp 7 µL vào giếng điện di bằng micropipet. Ghi chép lại thứ tự của các mẫu ADN với thứ tự của giếng. Chạy điện di ở điều kiện 90V, 400mA, thời gian khoảng 30 phút. Lúc này quan sát bằng mắt thường có thể thấy hỗn hợp mẫu trong giếng điện di dịch chuyển chậm từ phía cực âm sang cực dương.