3. Nội dung nghiên cứu
2.2.6. Tách dòng gen FLS
2.2.6.1. Nối đoạn gen FLS với vector pJET 1.2
PCR gen FLS sử dụng Dream Taq polymerase nên sản phẩm PCR tạo
ra đầu dính ở đầu 3’(3’dA). Do đó, đoạn gen cần phải xử lý đầu bằng trước khi được ghép nối với vector pJET 1.2 bằng cách sử dụng CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific). Sơ đồ vector pJET 1.2 được thể hiện ở hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ vector tách dòng pJET 1.2
Quy trình thực hiện:
Bước 1: Xử lý tạo đầu bằng sản phẩm PCR
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 2X Reaction Buffer 10
2 PCR product 1
3 H2O Up to 18
Bước 2: Hỗn hợp sau đó được đem đi trộn đều. Ủ hỗn hợp ở 70oC trong 5 phút sau đó đặt ngay lên đá.
Bước 3: Chuẩn bị phản ứng ghép nối giữa đoạn gen và vector. Bổ sung
thêm các thành phần sau vào trong hỗn hợp ban đầu:
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ghép nối giữa đoạn gen và vector
STT Thành phần Thể tích
(µl)
1 pJET 1.2/blunt Cloning Vector
1
2 T4 DNA Ligase 1
Bước 4: Ủ hỗn hợp phản ứng ở 22oC trong 5 phút. Sản phẩm sau ghép
nối được sử dụng để biến nạp ngay hoặc được giữ trong tủ lạnh – 20oC.
2.2.6.2. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến E.coli chủng DH10β
* Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến E.coli bằng CaCl2 lạnh dùng cho biến nạp sốc nhiệt.
Bước 1: Chủng vi khuẩn được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi
qua đêm ở 37oC.
Bước 2: Cấy một khuẩn lạc đơn vào 3ml môi trường LB lỏng, lắc qua
đêm ở 37oC, 200 vòng/ phút.
Bước 3: Chuyển 0.5 ml dịch nuôi trên sang 50 ml môi trường LB lỏng,
lắc tiếp khoảng 3h đến khi OD600nm đạt 0.8 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm đã giữ lạnh trên đá.
Bước 5: Hòa tan cặn nhẹ nhàng trong 30 ml CaCl2 0.1M, giữ ống tế bào trong đá 20 phút, ly tâm ở 4200 vòng/ phút, 4oC, 10 phút, thu cặn tế bào.
Bước 6: Lặp lại một lần bước 4 và hòa cặn nhẹ nhàng trong 1.5 ml CaCl2
0.1M.
Bước 7: Chia vào mỗi ống Eppendorf 50 µl dịch tế bào, bổ sung 50 µl
glycerol 60%, làm đông lạnh nhanh bằng Nitơ lỏng và giữ ở - 70oC.
* Phương pháp biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt.
Bước 1: Ống tế bào khả biến đã được để trong đá 30 phút sau khi lấy ra
từ tủ -70oC.
Bước 2: Hòa 7 µl sản phẩm của phản ứng ghép nối vào mỗi ống tế bào
khả biến sau đó tiếp tục giữ trong đá 30 phút.
Bước 3: Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút sau đó chuyển ngay xuống 0oC
và giữu trong 5 phút.
Bước 4: Bổ sung 0.3 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc ở 37oC trong 1 giờ.
Bước 5: Sau đó vi khuẩn được cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc chọn
lọc có bổ sung kháng sinh Ampicillin 50µg/µl và nuôi qua đêm ở 37oC.
2.2.6.3. Tách plasmid từ các dòng khuẩn lạc sau biến nạp
Bước 1: Nuôi vi khuẩn qua đêm trong ống nghiệm chứa 2 ml môi
trường LB lỏng có kháng sinh thích hợp ở 37oC trong máy lắc.
Bước 2: Thu tế bào vi khuẩn từ dịch nuôi bằng li tâm 6000 vòng/
phút trong 6 phút.
Bước 3: Bỏ dịch, thu cặn tế bào.
Bước 4: Bổ sung 150 µl dung dịch, vortex. Bước 5: Bổ sung 150 µl dung dịch II, đảo nhẹ.
Bước 6: Bổ sung 150 µl dung dịch III tiếp ngay sau đó, rồi để trên đá
khoảng 5 phút.
Bước 8: Bổ sung 1000 µl EtOH 100%, để tủ lạnh – 20oC trong 3h để kết tủa DNA.
Bước 9: Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC. Bỏ dịch, thu tủa DNA.
Bước 10: Rửa tủa DNA bằng cách bổ sung 300µl EtOH 70%, ly tâm
12000 vòng/ phút trong 6 phút, bỏ dịch, thu DNA.
Bước 11: Làm khô tủa DNA bằng máy SpeedVac trong 5 phút.
Bước 12: Bổ sung 50 µl RNase 0.01 mg/ml, ủ ở 37oC trong 1 giờ để loại bỏ RNA.
Bước 13: Điện di kiểm tra, plasmid sau đó được bảo quản ở - 20oC cho
đến khi sử dụng.
2.2.6.4. Phân tích DNA plasmid bằng enzyme giới hạn
Để xác định rõ xem plasmid đã lựa chọn có mang đoạn DNA lạ hay không thì cần sử dụng enzyme giới hạn để cắt kiểm tra. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng enzyme cắt đầu bằng BglII chỉ cắt gen vùng nhận biết của chúng trên vector (Bảng 2.6). Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37oC trong 1 giờ. Sản phẩm cắt enzyme giới hạn sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8%.
Bảng 2.7. Phản ứng cắt được tiến hành với thành phần
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 10X Tango Buffer 2 2 Plasmid (1 µg) 1 3 Enzyme (1 Ul) 0.2 4 H2O Ðến 20 2.2.7. Xác định trình tự gen
Trình tự gen được xác định trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer kết hợp với sử dụng bộ kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
2.2.8. Xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng
Sau khi xác định trình tự, các số liệu được xử lý bằng các phần mềm BLAST, BioEdit để so sánh trình tự gen FLS với các trình tự đã công bố trên
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách RNA tổng số từ các mẫu chè nghiên cứu
Tất cả các nghiên cứu trên gen đều được bắt đầu từ việc tách chiết một trong hai loại nucleic acid, đó là DNA và RNA. Sản phẩm tách chiết phải đảm bảo một số yêu cầu: tinh sạch, ít bị đứt gãy hay bị phân hủy bởi các tác nhân hóa học hay cơ học, lượng axit nucleic thu được phải đủ lớn đảm bảo cho việc tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme RNase. Hơn nữa, RNase có mặt ở khắc nơi, có hoạt tính cao và rất bền vững với các tác nhân thường dùng để loại bỏ enzyme (việc xử lý nhiệt ở 90oC trong 1 giờ không làm mất hoạt tính RNase). Vì những lý do đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi sự thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm bởi các RNase từ môi trường: thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hóa chất đều được khử trùng bằng nhiệt hay DEPC, tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng tay trần. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tách RNA tổng số từ lá 2 mẫu chè Trung du: Trung du xanh và tím theo quy trình tách chiết của bộ kit tách RNA thực vật GeneJET Plant RNA Purification Kit của hãng Thermo Scientific. Mỗi mẫu lại tách RNA tổng số ở 2 trạng thái bảo quản mẫu khác nhau: mẫu tươi và mẫu bảo quản trong RNAlater. Kết quả tách RNA tổng số được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.1) và đo kiểm tra nồng độ bằng máy đo quang phổ (Bảng 3.1).
Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số
Các mẫu điện di: 1. chè Trung du tím (RNAlater); 2. chè Trung du xanh (RNAlater); Maker (thang chuẩn 1kb); 4. chè Trung du tím; 5. chè Trung du xanh
Qua hình ảnh điện di cho thấy mẫu RNA tổng số tách được xuất hiện các băng đặc trưng cho rRNA. Các mẫu chè Trung du tím (RNAlater), chè Trung du tím và chè Trung du xanh trên ảnh điện di xuất hiện nhiều băng có kích thước khác nhau, vì thế có chứa RNA tổng số tuy nhiên lại xuất hiện băng sáng phía trên cùng chứng tỏ mẫu bị lẫn DNA tổng số. Các mẫu chè Trung du xanh (RNAlater) không thấy rõ các băng sáng có thể do lượng RNA quá ít.
Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra nồng độ RNA tổng số từ các mẫu chè Trung Du Mẫu chè Nồng độ (ng/µl) A260/A280
Chè tím (RNAlater) 723.2 2.07
Chè xanh (RNAlater) 161.9 1.93
Chè tím 704.6 2.03
Đồng thời kết quả đo OD cho thấy, mẫu RNA tách được có nồng độ và độ sạch cao. Điều này chứng tỏ rằng các mẫu RNA tổng số tách được khá nguyên vẹn, đảm bảo chất lượng các thí nghiệm sau. Các mẫu RNA tổng số lá chè được bảo quản trong tủ - 70 oC.
3.2. Nhân gen mã hóa Flavonol synthase từ các mẫu chè nghiên cứu
Từ kết quả tách chiết RNA tổng số, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp cDNA (theo kit Affymetrix) sử dụng mẫu RNA tổng số tách chiết từ là tươi. Sau đó, tiến hành phản ứng PCR nhân gen FLS với trình tự cặp mồi đặc hiệu
F331/ R331 được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của gen (Bảng 2.3) và mẫu cDNA sợi đơn tổng hợp ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Kết quả ở hình 3.1 cho thấy sản phẩm PCR nhân gen FLS ở các mẫu chè đều có kích thước khoảng 1 kb đúng với tính toán lý thuyết (Bảng 2.3) và công bố của Lin và đtg [24]. Ngoài ra, sản phẩm PCR ở mẫu chè Trung du xanh có băng phụ ~750bp.
Hình 3.2. Kết quả PCR nhân gen FLS từ cDNA
của hai mẫu chè Trung du xanh (chè xanh) và chè Trung du tím (chè tím) ở các nhiệt độ khác nhau; (-): đối chứng –; M: Maker;
Kết quả hình 3.2. cho thấy kỹ thuật PCR ở nhiệt độ gắn mồi tốt nhất là 600C với 30 chu kì. Sau khi tối ưu được nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu, chúng tôi đã tiến hành khuếch đại gen mã hóa FLS phục vụ tách dòng gen.
3.3. Tạo dòng gen FLS
Do sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất như mồi, đệm PCR, các nucleotide,...còn dư và đôi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình tách dòng. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch (thôi gel) sản phẩm PCR của 2 mẫu chè. Các đoạn gen sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lượng và xác định sơ bộ hàm lượng DNA tinh sạch. Sau đó, sản phẩm PCR được gắn vào vector pJET1.2, biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli DH10 và cấy trải trên môi trường LB đặc chọn lọc. Để xác định dòng vi khuẩn mang vector pJET1.2 chứa đoạn sản phẩm PCR, chúng tôi lựa chọn một số dòng vi khuẩn để tiến hành tách chiết plasmid. Kết quả tách plasmid được thể hiện trên hình 3.3 và hình 3.4.
Hình 3.3. Hình ảnh điện di tách plasmid của mẫu chè Trung du tím
Qua ảnh điện di hình 3.3 chỉ ra, dòng 6, 8 và 12 là các plasmid thu được có kích thước cao hơn đối chứng. Tương tự kết quả tách dòng sản phẩm PCR khuếch đại gen FLS ở mẫu chè Trung du tím, ở mẫu chè Trung du xanh thu được các dòng: 4, 11, 12, 13, 15, 16, 19 và 22 có kích thước cao hơn so với đối chứng (Hình 3.4). Do đó, bước đầu có thể khẳng định các dòng này có thể mang vector pJET1.2 có gắn đoạn sản phẩm PCR.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di tách plasmid của mẫu chè xanh
(-): vector pJET1.2; 1-22: plasmid thu được từ kết quả biến nạp
Từ kết quả tách chiết plasmid, chúng tôi tiếp tục phân tích một số plasmid bằng enzyme giới hạn, plasmid dòng 1 và 6 từ mẫu chè Trung du tím (ký hiệu T1 và T6) và dòng 19 và 22 (ký hiệu X19 và X22) từ mẫu chè Trung du xanh được xử lý bằng enzyme giới hạn BglII. Kết quả cắt kiểm tra bằng
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kiểm tra 4 dòng plasmid
M: maker 1kb; (+): sản phẩm tinh sạch đoạn FLS; (-): vector pJET1.2 không chứa đoạn chèn; plasmid T1, T6, X19, X22 cắt bằng enzyme BglII.
Sau khi phân tích các dòng plasmid tái tổ hợp bằng enzyme BglII. Kết
quả điện di cho thấy, plasmid T1 và X19 bị cắt thành 1 đoạn có kích thước tương ứng vector pJET1.2 (~3 kb), chứng tỏ vector pJET1.2 tự nối lại, plasmid T6 và X22 bị cắt thành hai đoạn: một đoạn lớn có kích thước tương ứng với vector pJET1.2 (~3 kb) và một đoạn nhỏ hơn có kích thước 1 kb tương ứng với sản phẩm PCR nhân gen FLS, đúng với tính toán lý thuyết do
khi cắt plasmid pJET1.2 bằng BglII sẽ thêm 39 nucleotide của vector nên sản phẩm cắt sẽ cao hơn so với sản phẩm PCR. Như vậy, bước đầu chúng tôi khẳng định các dòng plasmid này đã có gắn gen FLS. Để khẳng định chắc chắn đoạn chèn có phải là gen FLS hay không, chúng tôi tiếp tục tinh sạch các dòng plasmid này để giải trình tự.
3.4. Xác định và phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase
Chúng tôi đã xác định trình tự của gen FLS gắn với vector pJET 1.2. Sau khi phân tích trình tự, chúng tôi khẳng định được chắc chắn rằng đoạn cDNA
phân lập được là trình tự ORF hoàn chỉnh mã hóa FLS. Gen này có kích thước 996 bp, mã hóa 331 amino acid và mã kết thúc là TAA. Tiếp theo, chúng tôi tiến hành phân tích, so sánh trình tự gen FLS thu được với trình tự đã công bố
(DQ198089.1). Kết quả so sánh trình tự nucleotide và amino acid được thể hiện trên hình 3.6. FLS ATGGAGGTAGAGAGAGTGCAAGCCCTGTCCCATGTAACTCTCCATGAGCTCCCTGTAAAA 60 M E V E R V Q A L S H V T L H E L P V K FLS CT ...C.... 60 M E V E R V Q A L S H V T L H E L P A K FLS CX ...C.... 60 M E V E R V Q A L S H V T L H E L P A K FLS TTTATCCGACCGGTCCACGAGCAACCGGAGAACAGCAAGGCTATCGAAGGTGTCACCGTC 120 F I R P V H E Q P E N S K A I E G V T V FLS CT ...C... 120 F I R P A H E Q P E N S K A I E G V T V FLS CX ... 120 F I R P V H E Q P E N S K A I E G V T V FLS CCCGTGATCTCCCTCTCTCAACCACACGATGTGGTGGTCGATGCATTATCAAAGGCTTGT 180 P V I S L S Q P H D V VV D A L S K A C FLS CT ...G... 180 P V I S L S R P H D V VV D A L S K A C FLS CX ... 180 P V I S L S Q P H D V VV D A L S K A C FLS AGTGAATGGGGATTTTTCCTCATCACGGATCACGGTGTCGAGCCCTCGTTGATCGGACGG 240 S E W G F F L I T D H G V E P S L I G R FLS CT ... 240 S E W G F F L I T D H G V E P S L I G R FLS CX ... 240 S E W G F F L I T D H G V E P S L I G R FLS CTAAAAGAGGTTGGGGAGGAGTTCTTTAAGCTCCCACAGGAGGAGAAAGAGAGCTATGCA 300 L K E V G E E F F K L P Q E E K E S Y A FLS CT ...A... 300 L K E V G E E F F K L P Q K E K E S Y A FLS CX ... 300 L K E V G E E F F K L P Q E E K E S Y A FLS AATGATCCTTCAAGTGGGAGTTTTGAAGGGTATGGAACAAAGATGACTAAAAATTTTGAT 360 N D P S S G S F E G Y G T K M T K N F D FLS CT ... 360 N D P S S G S F E G Y G T K M T K N F D FLS CX ... 360 N D P S S G S F E G Y G T K M T K N F D FLS GAGAAAGTTGAGTGGATTGATTATTATTTTCACGTCATGCACCCTCCTAAGAAGCTCAAT 420 E K V E W I D Y Y F H V M H P P K K L N
FLS CT ... 420 E K V E W I D Y Y F H V M H P P K K L N FLS CX ... 420 E K V E W I D Y Y F H V M H P P K K L N FLS CTTGACATGTGGCCTAAGAACCCTTCTTCATACAGGGGAGTGACAGAGGAATACAATGTG 480 L D M W P K N P S S Y R G V T E E Y N V FLS CT ... 480 L D M W P K N P S S Y R G V T E E Y N V FLS CX ... 480 L D M W P K N P S S Y R G V T E E Y N V FLS GAAATAATGAGAACAACCAACAAGTTATTTGAACTTCTCTCAGAGGGACTAGGTTTGGAT 540 E I M R T T N K L F E L L S E G L G L D FLS CT ...C...G..G... 540 E I L R T T N K L L E L L S E G L G L D FLS CX ... 540 E I M R T T N K L F E L L S E G L G L D FLS GGGAAGGTTTTGAATTCTTCTTTGGGTGGTGATGAAATTGAATTTGAAATGAAAATCAAC 600 G K V L N S S L G G D E I E F E M K I N FLS CT ... 600 G K V L N S S L G G D E I E F E M K I N FLS CX ... 600 G K V L N S S L G G D E I E F E M K I N FLS ATGTACCCACCATGCCCACAACCTCAGCTCGCCCTCGGAGTTGAACCTCACACTGACATG 660 M Y P P C P Q P Q L A L G V E P H T D M FLS CT ...G... 660 M Y P P C P Q P E L A L G V E P H T D M FLS CX ... 660 M Y P P C P Q P Q L A L G V E P H T D M FLS TCTGCTCTCACTTTACTTGTCCCCAATGACGTTCCCGGTCTTCAAGTTTGGAAAGACGGT 720 S A L T L L V P N D V P G L Q V W K D G FLS CT ...A...G... 720 S A L T L L I P N D V P G L Q V W K D G FLS CX ...A 720 S A L T L L V P N D V P G L Q V W K D G FLS AATTGGGTAGCTGTCAATTACTTGCCAAATGCACTCTTCGTCCATGTTGGTGATCAACTT 780 N W V A V N Y L P N A L F V H V G D Q L FLS CT ...G... 780 N W V A V N Y L P N A L F V H V G D Q L FLS CX ...G... 780 N W V A V N Y L P N A L F V H V G D Q L FLS GAGGTACTAAGCAATGGTAAGTACAAGAGTGTTCTTCACAGGAGCTTGGTGAACAAAGAA 840 E V L S N G K Y K S V L H R S L V N K E FLS CT ...T... 840
E V L S N G K Y K S V L H R S L V N K E FLS CX ...T... 840 E V L S N G K Y K S V L H R S L V N K E FLS AGGACAAGAATGTCTTGGGCTGTGTTTGTCGTGCCTCCTCATGAAGCAGTGATTGGACCT 900 R T R M S W A V F V V P P H E A V I G P FLS CT ... 900 R T R M S W A V F V V P P H E A V I G P FLS CX ... 900 R T R M S W A V F V V P P H E A V I G P FLS CTTCCAGAGCTCATTGATGAGAAAAACCCAGCAAAATATTCAACCAAAACATATGCCGAG 960 L P E L I D E K N P A K Y S T K T Y A E FLS CT ... 960 L P E L I D E K N P A K Y S T K T Y A E FLS CX ... 960 L P E L I D E K N P A K Y S T K T Y A E FLS TACCGTTATCGCAAATTCAATAAGATTCCCCAATAA 996 Y R Y R K F N K I P Q * FLS CT ...A... 996 Y R Y R K F N K I P Q * FLS CX ...A... 996 Y R Y R K F N K I P Q *
Hình 3.6. Kết quả phân tích trình tự gen FLS phân lập từ mẫu chè xanh và chè tím FLS: Trình tự gen FLS từ chè được công bố trên Genbank với mã số DQ198089.1; FLS CT: trình tự gen FLS phân lập từ mẫu chè Trung du tím; FLS CX: trình tự gen FLS phân lập từ mẫu chè Trung du xanh; Trình tự nucleotide thay đổi làm thay đổi trình tự amino acid ( ); Trình tự nucleotide thay đổi không làm thay đổi trình tự amino acid ( )
Trình tự nucleotide gen FLS phân lập từ chè Trung du xanh và Trung
du tím có 9 vị trí sai khác nucleotide (0,009%), dẫn đến sự sai khác ở 7 vị trí amino acid (0,007%). Khi so sánh trình tự gen FLS từ 2 mẫu nghiên cứu với trình tự đã đăng ký trên ngân hàng GenBank (DQ198089.1), chúng tôi thấy có sự sai khác 13 vị trí nucleotide (Bảng 3.2), đặc biệt ở vị trí nucleotide 57, 756,
825 và 990 gen FLS ở cả hai mẫu chè nghiên cứu tương ứng là C, G, T và A trong khi trình tự gen FLS công bố tương ứng là A, C, C và C. Trong 13 vị trí sai khác nucleotide, gen FLS từ mẫu chè Trung du xanh có 5 vị trí sai khác