3. Nội dung nghiên cứu
3.3. Tạo dòng gen FLS
Do sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất như mồi, đệm PCR, các nucleotide,...còn dư và đôi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình tách dòng. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch (thôi gel) sản phẩm PCR của 2 mẫu chè. Các đoạn gen sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lượng và xác định sơ bộ hàm lượng DNA tinh sạch. Sau đó, sản phẩm PCR được gắn vào vector pJET1.2, biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli DH10 và cấy trải trên môi trường LB đặc chọn lọc. Để xác định dòng vi khuẩn mang vector pJET1.2 chứa đoạn sản phẩm PCR, chúng tôi lựa chọn một số dòng vi khuẩn để tiến hành tách chiết plasmid. Kết quả tách plasmid được thể hiện trên hình 3.3 và hình 3.4.
Hình 3.3. Hình ảnh điện di tách plasmid của mẫu chè Trung du tím
Qua ảnh điện di hình 3.3 chỉ ra, dòng 6, 8 và 12 là các plasmid thu được có kích thước cao hơn đối chứng. Tương tự kết quả tách dòng sản phẩm PCR khuếch đại gen FLS ở mẫu chè Trung du tím, ở mẫu chè Trung du xanh thu được các dòng: 4, 11, 12, 13, 15, 16, 19 và 22 có kích thước cao hơn so với đối chứng (Hình 3.4). Do đó, bước đầu có thể khẳng định các dòng này có thể mang vector pJET1.2 có gắn đoạn sản phẩm PCR.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di tách plasmid của mẫu chè xanh
(-): vector pJET1.2; 1-22: plasmid thu được từ kết quả biến nạp
Từ kết quả tách chiết plasmid, chúng tôi tiếp tục phân tích một số plasmid bằng enzyme giới hạn, plasmid dòng 1 và 6 từ mẫu chè Trung du tím (ký hiệu T1 và T6) và dòng 19 và 22 (ký hiệu X19 và X22) từ mẫu chè Trung du xanh được xử lý bằng enzyme giới hạn BglII. Kết quả cắt kiểm tra bằng
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kiểm tra 4 dòng plasmid
M: maker 1kb; (+): sản phẩm tinh sạch đoạn FLS; (-): vector pJET1.2 không chứa đoạn chèn; plasmid T1, T6, X19, X22 cắt bằng enzyme BglII.
Sau khi phân tích các dòng plasmid tái tổ hợp bằng enzyme BglII. Kết
quả điện di cho thấy, plasmid T1 và X19 bị cắt thành 1 đoạn có kích thước tương ứng vector pJET1.2 (~3 kb), chứng tỏ vector pJET1.2 tự nối lại, plasmid T6 và X22 bị cắt thành hai đoạn: một đoạn lớn có kích thước tương ứng với vector pJET1.2 (~3 kb) và một đoạn nhỏ hơn có kích thước 1 kb tương ứng với sản phẩm PCR nhân gen FLS, đúng với tính toán lý thuyết do
khi cắt plasmid pJET1.2 bằng BglII sẽ thêm 39 nucleotide của vector nên sản phẩm cắt sẽ cao hơn so với sản phẩm PCR. Như vậy, bước đầu chúng tôi khẳng định các dòng plasmid này đã có gắn gen FLS. Để khẳng định chắc chắn đoạn chèn có phải là gen FLS hay không, chúng tôi tiếp tục tinh sạch các dòng plasmid này để giải trình tự.