4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.2.4. Ứng dụng của nuôi cấy mô trong nghiên cứu và ứng dụng trong
nghiệp
1.2.4.1. Vi nhân giống
Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro được áp dụng phổ biến trong nông nghiệp nhờ có hệ số nhân nhanh hơn phương pháp thông thường.Vi nhân giống được ứng dụng để: Phục tráng giống cây trồng bị bệnh, nhân nhanh các giống cây trồng mà khả năng nhân giống thông thường khó khan, nhân nhanh số lượng lớn các cây giống trong thời gian ngắn và đảm bảo đặc tính di truyền của bố mẹ [19] .
1.2.4.2. Sản xuất và bảo quản giống cây sạch bệnh
Nuôi cấy in vitro có khả năng sản xuất hàng loạt cây sạch bệnh từ những cây bị nhiễm virus nhờ kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây sạch bệnh có khả năng nhân nhanh, trao đổi giống và bảo quản in vitro [19].
1.2.4.3. Bảo quản giống in vitro
Phương thức duy nhất an toàn cho lai giống và tạo giống mới là phải có ngân hàng giống. Giữ tập đoàn giống cho đến nay là một vấn đề nan giải cho những cây trồng nhân vô tính hay cây đa bội. Bảo quản in vitro trong thời gian dài bằng phương pháp sinh trưởng chậm bước đầu đã giải quyết được một phần. Hạn chế của phương pháp này là có những biến đổi về mặt di truyền do thời gian nuôi cấy kéo dài [19].
1.2.4.4. Biến dị tế bào soma
Cây để tái sinh in vitro từ nuôi cấy cơ quan, mô sẹo và protoplast thường có những thay đổi về hình thái hay nói một cách khác là biến dị tế bào soma. Những thay đổi qua nuôi cấy in vitro có thể do tình trạng sinh lí mẫu cấy, thể bội của cây trồng, trao đổi chéo DNA, thời gian, điều kiện nuôi cấy và môi trường nuôi cấy… Những biến dị tế bào soma thu được này có thể dẫn đến hình thành giống mới qua chọn dòng. Phương thức chọn dòng này có thể thu ngắn một nửa thời gian chọn giống mới [10].
1.2.4.5. Lai đơn bội
Cây đơn bội được tạo ra qua nuôi cấy hạt phấn và túi phấn. Cây đơn bội thể hiện được đặc tính thuần khiết của giống và là nguyên liệu hoàn hảo được sử dụng trong lai giống [19].
1.3. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước 1.3.1. Trên thế giới
Thông thường Paphiopedilum được nhân giống bằng gieo trồ ng ha ̣t hay tách cây con đã trưởng thành ra khỏi cây me ̣. Tuy nhiên tỷ lệ hạt nảy mầm trong tự nhiên lại rất thấp vì hạt lan Hài quá nhỏ, không chứa chất dự trữ và chỉ có một phôi chưa phân hóa nên không thể phát triển theo phương thức bình thường được do đó các loài lan Hài rất hiếm dạng dại vì thế hiệu quả nhân giống thấp nên không đáp ứng nhu cầu của thi ̣ trường [6]. Phương pháp nuôi cấy in vitro cho phép tạo
ra một lượng lớ n cây con trong thời gian ngắn đã trở thành một giải pháp để bảo vệ lan Hài thoát khỏi nguy cơ tuyê ̣t chủng.
Các nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy mô lan Hài đươ ̣c thực hiê ̣n bởi Bubeck năm 1973, ông đã tiến hành nuôi cấy mô phân sinh của 3 loại lan Hài và 8 loại lan Hài lai. Môi trường nuôi cấy chủ yếu sử dụng MS (1962) hoặc môi trường này nhưng có cải biên [23]. Năm 1975 Stewart và cs tiến hành cảm ứng chồi bên để tạo ra mô se ̣o, đôi khi có sự hình thành mô ̣t vài cây con trong quá trình nuôi cấy.
Tuy nhiên các mô se ̣o rất khó tái sinh, sau mô ̣t thời gian nuôi cấy những mô se ̣o này sẽ chết. Vì lý do này nên hầu hết các nghiên cứu về nuôi cấy mô
Paphiopedilum đều sử du ̣ng nguồ n vâ ̣t liê ̣u ban đầu từ ha ̣t [40].
Theo Liu và cộng sự (2006) thì loài lan Hài P.armeniacum có khoảng thời gian từ khi hạt nảy mầm đến khi hình thành cây phải mất 4 năm [35].
Những nỗ lực để tạo ra các khối mô sẹo của lan Hài từ các đoạn gốc, thân đã không thành công. Tuy nhiên một vài loài lan Hài lai đã thành công trong việc tạo ra protocorms, mô sẹo, chồi, hạt. Điều đó nói lên rằng lan Hài lai dễ nhân hơn so với các loài bản địa. Do đó việc nhân giống các loài lan Hài chủ yếu đạt được bằng cách tạo ra sự cộng sinh của hạt để thuận lợi cho sự nảy mầm của hạt trong nuôi cấy mô [24]; [29]; [34].
Kết quả nghiên cứu của Ding và cs (2004) về ảnh hưởng sự chín của hạt giống, môi trường nuôi cấy, nguồn carbon và các chất phụ gia hữu cơ đến sự nảy mầm, phát triển protocorm của lan P.armeniacum đã cho thấy khi sử dụng hạt giống đạt 200 ngày tuổi tỷ lệ nảy mầm của hạt đạt cao nhất trong khi tỷ lệ nảy mầm của hạt sau thụ phấn 300 ngày là thấp nhất. Điều này là do sau khi thụ phấn kéo dài thì hạt có hiện tượng hình thành vỏ (được quan sát dưới kính hiển vi) và nó đã ngăn cản sự hấp thu dinh dưỡng của hạt làm cho tỷ lệ nảy mầm giảm đi đáng kể [27].
Theo Lee (1998) sự nảy mầm của loài P.delenatii tối ưu tại thời điểm 150
ngày sau thụ phấn (68%), tỷ lệ nảy mầm giảm mạnh khi hạt thu ở 210 ngày sau thụ phấn do khi này hạt đã chín đầy đủ. Ở 150 ngày sau thụ phấn, lớp cutin được hình thành đầy đủ và các tế bào noãn đã hình thành không bào, do đó cho phép sự hấp thu dinh dưỡng tốt nhất [31].
Kết quả nghiên cứu của Lee (1998), Ding và cs (2004) cho thấy ảnh hưởng của sự trưởng thành hạt giống đến sự nảy mầm phụ thuộc vào loài. Sự nảy mầm của hạt lan là tương đối thấp do nội nhũ không phát triển trong quá trình phát triển của hạt, hơn nữa vỏ hạt rất mỏng có thể không đủ để bảo vệ phôi từ sự khô
hạn. Sự hình thành của một lớp biểu bì trên bề mặt phôi có thể đảm bảo duy trì độ ẩm cho các tế bào phôi cũng như bảo vệ sự tác động của điều kiện vật lý. Tuy nhiên lớp biểu bì làm giảm tỷ lệ nảy mầm của hạt trong ống nghiệm [27], [31].
Các kết quả nghiên cứu về thành phần môi trường nuôi cấy đến sự nảy mầm của hạt lan Hài của Lee và cs (2010) đã cho thấy có mối quan hệ giữa lượng muối khoáng tương đối thấp và nồng độ N vô cơ trong môi trường KC và VW (nồng độ muối khoáng KC: 13,42 mM; WV: 16,3 mM; nồng độ N vô cơ KC: 12,25 mM; VW: 3,78 mM ). Sự nảy mầm đạt cao nhất trên môi trường KC. Hiệu quả kích thích sự nảy mầm của hạt lan trên môi trường KC do có một lượng canxi tương đối cao nồng độ (4,23 mM) so với VW (1,94 mM), và ¼ MS, ½MS (0,75 và 1,5 mM). Việc cung cấp canxi ảnh hưởng đến tăng trưởng và sự phân chia nhân của thực vật. Protocorm thu được trên VW lớn hơn trên ½ MS, do nồng độ phosphate tương đối cao (4,74 mM) của VW so với ¼ MS và ½ MS (0,32 mM và 0,62 mM) và KC (1,84 mM). Phosphate được hấp thu bởi rễ đã kích thích tăng trưởng protocorm [33].
Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn carbon khác nhau đến sự nảy mầm của hạt lan Hài loài P.armeniacum và P.micranthun, Chen và cs đã nhận thấy sự nảy mầm của hạt đạt cao nhất trên môi trường có bổ sung glucose và cao gấp 2 lần so với môi trường có saccarose [25].
Theo Chyuam và cs (2011) thì số lượng chồi của lan Hài lai tăng gấp hai lần sau 12 tuần nuôi cấy khi môi trường có bổ sung BA và NAA. Trong khi đó TDZ ức chế sự dài ra của chồi cũng như rễ [26]. Kết quả của Chen và cộng sự (2004) cho thấy rằng, trong nhiều trường hợp lan Hài hình thành chồi ít hơn so với các loại hoa lan khác [24].
Năm 2011 Liao và các cô ̣ng sự cũng đã tái sinh chồi từ mô se ̣o của cây con hoàn chỉnh từ nu ̣ hoa của P. deperle và P. armeni. Tuy nhiên cần rất nhiều thờ i gian để cho cây lan Hài ra hoa vì vâ ̣y phương pháp này kém hiê ̣u quả hơn các phương pháp khác [33].
1.3.2. Trong nước
Trước kia do lan Paphiopedilum là giống lan đơn thân nên người ta thường dùng phương pháp tách bụi để nhân giống. Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và cây con tách ra có tỷ lệ sống cao nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu cây giống nên người ta ít sử dụng phương pháp này [14].
Khi nghiên cứu đa dạng di truyền loài lan Hài Đốm (Paphiopedilum concolor Pfitzer) bản địa của Việt Nam (2009), tác giả Khuất Hữu Trung và cộng sự đã nhận xét: Loài lan Hài Đốm (P. concolor Pfitzer) bản địa của Việt Nam rất đa dạng và phong phú. Các mẫu giống thu thập tại các vùng sinh thái khác nhau đều có các đặc điểm đặc trưng riêng về hình thái. Kết quả phân tích bằng kỹ thuật RAPD – PCR chỉ ra hệ số tương đồng di truyền của các mẫu Hài đốm dao động từ 0,56 đến 0,94; 16 mẫu lan Hài Đốm nghiên cứu được phân thành 6 nhóm khác nhau. Phương pháp mô tả các đặc điểm hình thái và phương pháp đánh giá đa hình di truyền ở mức độ ADN có thể bổ sung và hỗ trợ lẫn nhau để công việc phân loại dưới loài trở nên chính xác hơn, phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng một cách có hiệu quả các nguồn gen lan Hài bản địa của Việt Nam [21].
Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005, 2007) đã nhân giống được loài lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) một loài lan đặc hữu của Việt Nam bằng kỹ thuật gây vết thương cơ giới, nuôi cấy lỏng và kéo dài đốt thân có chứa mắt để tái sinh chồi từ việc sử dụng các hạt lan sáu tháng tuổi được nuôi cấy trên môi trường Knudson C kết hợp với việc gây vết thương và nuôi cấy trên môi trường lỏng đã thu được 5,2 chồi/mẫu ban đầu khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung TDZ 1,0 mg/l. Còn các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử dụng ánh sáng trắng của đèn huỳnh quang và ánh sáng đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi môi trường có bổ sung BA 2 mg/l, còn trên môi trường có bổ sung Zeatin 1,5 mg/l hoặc TDZ 1,5 mg/l thì cho chất lượng chồi tốt nhất [15]; [36]; [37]; [38].
Vào năm 2006 các nhà khoa học thuộc Viện Ứng dụng Công nghệ đã nhân giống thành công hai loài lan quý: Hài Hằng và Hài Tam Đảo bằng kỹ thuật gieo hạt trong ống nghiệm và kỹ thuật gây vết thương trên cây con trong ống nghiệm. Hai loài lan này nhân giống rất khó vì hạt nhỏ, dài chừng 1 – 2 mm, rộng chừng 1mm, chứa rất ít và hầu như không có chất dinh dưỡng để tạo điều kiện cho hạt nảy mầm. Do đó nếu gieo hạt trong môi trường đất hạt rất dễ bị mất mát và khó nảy mầm. Từ những kết quả đạt được, nhóm nghiên cứu do PGS.TS. Đặng Xuyến Như phụ trách đã xây dựng được qui trình nhân giống hai loài lan Hài quí trên bằng phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm. Đồng thời họ cũng tìm ra phương pháp tách mầm như một biện pháp bổ sung để nhân giống Hài Hằng và Hài Tam Đảo. Không dừng tại đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành công việc nuôi trồng những cây con nói trên trong vườn ươm [14] .
Trong nghiên cứu của Vũ Quốc Luận và cs (2014) về lan Hài Hồng cho thấy các chồi non lan Hài Hồng có 4 lá được cấy vào môi trường SH có bổ sung BA 0,5 mg/l; NAA 0,5 mg/l; đường sucrose 30 g/l; agar 9,0 g/l; than hoạt tính 1 g/l và được nuôi trong điều kiện che tối hoàn toàn trong 4 tháng nhằm kéo dài các đốt thân, sau đó được đưa ra điều kiện chiếu sáng thêm 2 tháng để lá tổng hợp diệp lục tố và các năng lượng cần thiết cho cây. Kết quả cho thấy các chồi non được kéo dài trung bình 10,5 cm, với số lá mới hình thành trung bình 5 lá/chồi, tương ứng với 5 đốt/chồi thu được sau 120 ngày nuôi trong điều kiện tối. Sau đó các chồi được đưa sang điều kiện chiếu sáng 60 ngày, các chồi non tiếp tục hình thành lá mới tuy nhiên không nhận thấy có sự phân đốt. Sau 180 ngày nuôi cấy các chồi được cắt thành 5 đốt riêng biệt với 1 lá và 1 rễ, riêng phần đỉnh chồi được giữ nguyên với 3 lá và 2 rễ. Cuối cùng các đốt thân được trồng trên giá thể dớn Đài Loan thu được kết quả cao nhất ở vị trí đốt thân số 1 với tỷ lệ sống sót (100%) sau 12 tháng [8].
Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi
cho thấy, môi trường nhân nhanh protocorm và tạo chồi là môi trường RE có bổ sung nước dừa 150 ml/l và chuối chín 100 g/l cho hệ số nhân cao nhất (4,3 lần). Bổ sung NAA 0,4 mg/l – 0,6 mg/l vào môi trường cho khả năng ra rễ tố t nhất. Các kết quả thí nghiệm ngoài vườn ươm cho thấy, cây đạt tiêu chuẩn ra vườn ươm cao 3 – 4 cm, có từ 3 – 4 lá, 4 – 5 rễ [4].
Ở Việt Nam, nhóm tác giả Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp đã có những nghiên về mặt thực vật học đối với lan Hài Việt Nam thông qua những chuyến khảo sát thực tế. Trong cuốn sách “Lan Hài Việt Nam” nhóm tác giả đã giới thiệu khá đầy đủ và chi tiết các loài lan Hài có ở Việt Nam cùng các đánh giá về thực trạng của các loài này [1].
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Giống lan Hài Giáp khoẻ mạnh, sạch bệnh, được lưu giữ tại vườn lan Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Vật liệu nghiên cứu: Quả loài lan Hài Giáp được sử dụng để làm nguồn vật liệu ban đầu cho thí nghiệm.
Hình 2.1: Cây và quả lan Hài Giáp
(Nguồn: www.vuonhoalan.net) [42]
2.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng nhân nhanh và ra rễ giống lan Hài Giáp bằng phương pháp in vitro quy mô phòng thí nghiệm.
2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật, bộ môn CNSH thuộc Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên
2.4. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 2.4.1. Hóa chất 2.4.1. Hóa chất
Bảng 2.1: Hóa chất nghiên cứu
Hóa chất Hãng sản xuất
Than hoạt tính Việt Nam
Agar, đường Sacarose Việt Nam
HgCl2 Biobasic, Canada NAA Sigma, Đức BA Sigma, Đức MS Duchefa, Hà Lan B5 Duchefa, Hà Lan WPM Duchefa, Hà Lan Cồn Việt Nam 2.4.2. Thiết bị
Bảng 2.2: Thiết bị nghiên cứu
Thiết bị Hãng sản xuất
Tủ cấy vô trùng cấp I Airtech
Cân điện tử Olhous – Vietlabcu
Nồi hấp khử trùng ALP
Tủ sấy Memmert
Máy chuẩn pH Hanna HI2210
Bộ pippet Kingson
2.4.3. Dụng cụ
Panh, dao, kéo, thìa, đĩa peptri, ống đong, cốc đong, đèn cồn, giấy thấm, bình nuôi cấy, túi nilon.
2.5. Phương pháp nghiên cứu
Các bước nghiên cứu được tóm tắt theo sơ đồ sau:
Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm
2.5.1. Phương pháp chuẩn bị môi trường và điều kiện nuôi cấy
2.5.1.1. Chuẩn bị môi trường
Môi trường nuôi cấy sử dụng các loại môi trường cơ bản như: MS (Murashige and Skoog), B5 (Gamborg), WPM (Woody Plant Medium) có bổ sung thêm 1 số thành phần như đường sacarose 30 g/l, nước dừa 150 ml/l, agar 6 g/l,…Môi trường được điều chỉnh pH 5,6 – 5,8.
Quả lan Hài Giáp
Khử trùng
Tạo protocorm
Tạo đa chồi
Tạo rễ
Các chất kích thích sinh trưởng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm.
Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1atm trong 20 phút.
2.5.1.2. Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm nuôi cấy trong phòng được duy trì trong điều kiện: Nhiệt độ phòng: 22 – 25oC; cường độ chiếu sáng thấp, ẩm độ: 60 – 65%; quang chu kì: