4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.4. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
2.4.1. Hóa chất
Bảng 2.1: Hóa chất nghiên cứu
Hóa chất Hãng sản xuất
Than hoạt tính Việt Nam
Agar, đường Sacarose Việt Nam
HgCl2 Biobasic, Canada NAA Sigma, Đức BA Sigma, Đức MS Duchefa, Hà Lan B5 Duchefa, Hà Lan WPM Duchefa, Hà Lan Cồn Việt Nam 2.4.2. Thiết bị
Bảng 2.2: Thiết bị nghiên cứu
Thiết bị Hãng sản xuất
Tủ cấy vô trùng cấp I Airtech
Cân điện tử Olhous – Vietlabcu
Nồi hấp khử trùng ALP
Tủ sấy Memmert
Máy chuẩn pH Hanna HI2210
Bộ pippet Kingson
2.4.3. Dụng cụ
Panh, dao, kéo, thìa, đĩa peptri, ống đong, cốc đong, đèn cồn, giấy thấm, bình nuôi cấy, túi nilon.
2.5. Phương pháp nghiên cứu
Các bước nghiên cứu được tóm tắt theo sơ đồ sau:
Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm
2.5.1. Phương pháp chuẩn bị môi trường và điều kiện nuôi cấy
2.5.1.1. Chuẩn bị môi trường
Môi trường nuôi cấy sử dụng các loại môi trường cơ bản như: MS (Murashige and Skoog), B5 (Gamborg), WPM (Woody Plant Medium) có bổ sung thêm 1 số thành phần như đường sacarose 30 g/l, nước dừa 150 ml/l, agar 6 g/l,…Môi trường được điều chỉnh pH 5,6 – 5,8.
Quả lan Hài Giáp
Khử trùng
Tạo protocorm
Tạo đa chồi
Tạo rễ
Các chất kích thích sinh trưởng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm.
Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1atm trong 20 phút.
2.5.1.2. Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm nuôi cấy trong phòng được duy trì trong điều kiện: Nhiệt độ phòng: 22 – 25oC; cường độ chiếu sáng thấp, ẩm độ: 60 – 65%; quang chu kì: 16h sáng/8h tối.
2.5.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro
2.5.2.1. Khử trùng hạt
Khử trùng sơ bộ: Quả lan Hài Giáp sau thu thập được rửa sạch bằng dung dịch xà phòng loãng sau đó tráng sạch dưới vòi nước và dùng nước cất tráng mẫu từ 3 – 4 lần.
Khử trùng trong box cấy: Ngâm mẫu với dung dịch cồn 70o trong 1 phút và tráng sạch bằng nước cất nhiều lần. Tiếp tục ngâm mẫu trong dung dịch HgCl2
0,1% ở các mức thời gian khác nhau: 0 phút, 2 phút, 5 phút, 8 phút, 10 phút, sau đó tráng nước cất 5 – 7 lần.
Gắp mẫu đặt lên giấy thấm đã được vô trùng. Dùng dao cấy cắt bỏ phần bị hóa chất bào mòn. Dùng dao tách quả, tiến hành gieo hạt trên nền môi trường đã chuẩn bị trước. Sau đó đưa vào phòng nuôi, tiến hành theo dõi mẫu (quan sát bằng mắt thường).
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ bình mẫu sống không nhiễm + Tỷ lệ bình mẫu sống nhiễm
2.5.2.2. Môi trường nuôi cấy
(1) Môi trường nảy mầm hạt
Sau khi quả lan được khử trùng, tiến hành gieo hạt trên các môi trường nền dinh dưỡng khác nhau: Môi trường đối chứng (không chứa khoáng đa lượng, vi lượng), môi trường MS, B5, WPM để thăm dò khả năng kích thích nảy mầm trong điều kiện tối ưu của từng loài môi trường.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ nảy mầm của hạt.
(2) Môi trường nhân chồi
Hạt nảy mầm tạo thành các cụm chồi sẽ được chuyển qua môi trường để nhân nhanh cụm chồi. Môi trường thích hợp ở thí nghiệm 2 + đường saccarose 30 g/l + than hoạt tính 1 g/l + agar 6 g/l + nước dừa 150 ml/l sẽ được dùng làm môi trường nền có bổ sung các chất kích sinh trưởng và chất hữu cơ thích hợp tùy từng thí nghiệm.
Chỉ tiêu theo dõi: + Hệ số nhân + Chiều cao chồi + Chất lượng chồi
(3) Môi trường tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Những chồi tạo ra trên môi trường nhân nhanh có từ 2 – 3 lá được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ bổ sung chất kích thích sinh trưởng NAA và than hoạt tính ở các nồng độ khác nhau nhằm thăm dò khả năng kích thích ra rễ.
Chỉ tiêu theo dõi: + Tỷ lệ chồi ra rễ + Số rễ trung bình/chồi
+ Chiều dài rễ + Chất lượng rễ
2.5.2.3. Đưa cây ra ngoài tự nhiên
Phương pháp ra cây: Trước khi đưa cây con ra trồng ngoài tự nhiên, thường tiến hành huấn luyện để cây quen dần với điều kiện môi trường bên ngoài bằng cách: đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên, không cho ánh sáng chiếu trực tiếp vào bình nuôi cấy. Thời gian này kéo dài khoảng 10 ngày, tăng dần cường độ vào những ngày cuối để tăng nhanh khả năng thích nghi của cây. Sau đó, các bình cây được mở nắp, đổ nước vào ngâm 15 phút, lắc nhẹ để thạch rời ra khỏi rễ, dùng panh gắp nhẹ các cây ra khỏi bình không để dập nát. Rửa sạch phần thạch bám vào vì đó thường là môi trường thích hợp cho nấm bệnh phát triển hoặc côn trùng tấn công. Sau đó để cây chỗ râm mát rồi đem trồng vào giá thể.
Cần xử lý các giá thể bằng thuốc tím để khử trùng nấm trước khi trồng cây. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng các loại giá thể khác nhau nhằm đánh giá ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan Hài Giáp.
Chỉ tiêu theo dõi: + Tỷ lệ sống + Chiều cao cây
2.5.3. Phương pháp xử lí số liệu
- Sau khi tiến hành nuôi cấy và thu thập số liệu, số liệu thu được sẽ được tính toán trên phần mềm Excel theo hướng dẫn của Chu Văn Mẫn [11].
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1 % đến quả lan Hài Giáp HgCl2 0,1 % đến quả lan Hài Giáp
Trong quá trình nuôi cấy in vitro vô trùng mẫu là giai đoạn khở i đầu và quyết đi ̣nh sự thành công của quá trình nuôi cấy. Để có được vật liệu khởi đầu sạch nấm và vi khuẩn, việc lựa chọn chất khử trùng, nồng độ, thời gian rất quan trọng. Trong quá trình nghiên cứu và tìm hiểu khả năng tạo mô sạch trong nuôi cấy in vitro trên đối tượng Phong lan nói chung và lan Hài nói riêng, chúng tôi nhận thấy có nhiều nhất chất hóa học có hoạt tính diệt nấm và vi khuẩn mạnh như Calcium hypochlorid Ca(OCl)2, thuỷ ngân clorua (HgCl2), hydroxid (H2O2),....Tuy nhiên HgCl2 được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng bởi chúng có hoạt tính khử trùng tốt, cho tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao [19]. Vì vâ ̣y trong đề tài này chúng tôi chọn HgCl2 ở nồng độ 0,1% với các mức thời gian khử trùng khác nhau để tạo vâ ̣t liê ̣u nuôi cấy vô trùng. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% đến quả lan Hài Giáp
Công thức (CT) Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ bình mẫu sống không nhiễm (%) Tỷ lệ bình mẫu sống nhiễm (%) Tỷ lệ bình mẫu chết (%) CT 1 0 0 100 0 CT 2 2 45,94 ± 2,4 43,88 ± 2,2 10,18 ± 2,7 CT 3 5 71,78 ± 1,3 16,72 ± 1,8 11,5 ± 1,3 CT 4 8 61,16 ± 1,1 15,92 ± 1,5 22,92 ± 0,9 CT 5 10 54,22 ± 1,8 13,64 ± 0,8 32,14 ± 1,6
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy:
Xét về chỉ tiêu bình mẫu sống không nhiễm, chúng tôi nhận thấy thời gian khử trùng có ảnh hưởng rõ rệt tới chỉ tiêu này. Ở nồng độ HgCl2 0,1% từ CT3 đến CT4 tương ứng với thời gian khử trùng từ 5 đến 8 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất. Ở CT3 tỷ lệ bình mẫu sống không nhiễm đạt 71,78%. Tuy nhiên khi thời gian khử trùng tăng lên 10 phút tỷ lệ bình mẫu sống không nhiễm giảm xuống còn 54,22%.
Xét về chỉ tiêu bình mẫu sống nhiễm, ở công thức đối chứng khi không sử dụng chất khử trùng toàn bộ hạt sẽ bị nhiễm sau 15 ngày theo dõi. Khi tăng thời gian khử trùng từ 2 phút lên 10 phút tỷ lệ bình mẫu sống nhiễm giảm từ 43,88 % xuống còn 13,64%, đồng thời tỷ lệ bình mẫu chết tăng lên từ 10,18% lên 32,14%. Điều này được giải thích rằng: Khi khử trùng mẫu bằng HgCl2 ở mô ̣t nồ ng đô ̣ nhất đi ̣nh, thời gian khử trùng càng dài khả năng tiêu diê ̣t vi khuẩn, nấm càng tăng do đó tỷ lệ mẫu nhiễm càng giảm. Tuy nhiên HgCl2 là loại hoá chất có khả năng gây độc và làm chết mẫu nên thời gian khử trùng mẫu càng dài và nồng đô ̣ chất khử trùng càng cao thì hoá chất khử trùng sẽ ngấm vào mẫu càng nhiều và làm tăng tỷ lệ mẫu chết.
Chúng tôi đã sử dụng phương pháp so sánh mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis. Kết quả phân tích cho thấy tỉ lệ bình mẫu sống không nhiễm ở các công thức thực sự khác nhau ở độ tin cậy 95%. Sử dụng hàm Anova Single Factor phân tích phương sai một nhân tố (thời gian khử trùng trong HgCl2 0,1%) nhằm tìm nguyên nhân của sự sai khác trên, kết quả cho thấy F > F crit, do đó tỉ lệ bình mẫu sống không nhiễm ở các công thức khác nhau là do khác nhau về thời gian xử lí HgCl2 0,1%.
Vì vậy để khử trùng quả lan Hài Giáp được hiệu quả, chúng tôi lựa chọn công thức sử dụng cồn 70o kết hợp với HgCl2 0,1% trong 5 phút.
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt lan Hài Giáp
Dương Tấn Nhựt và cs (2005) đã nhân giống thành công lan Hài Hồng (Paphiopedilum delentii) bằng phương pháp gieo hạt in vitro. Sau đó tái tạo chồi bằng cách gây vết thương trên các mầm thu được từ gieo hạt và nuôi cấy trên môi trường lỏng đã thu được hệ số nhân là 5,2 lần [37]; [38]. Dựa vào nền tảng đó, chúng tôi cũng mong muốn tìm ra được môi trường thích hợp để nhân giống loài lan Hài Giáp bằng phương pháp gieo hạt in vitro.
Thí nghiệm sử dụng các nền môi trường dinh dưỡng phổ biến gồm MS, B5, WPM để tiến hành gieo hạt. Hạt được nuôi cấy trên các môi trường nền khác nhau có bổ sung đường 30 g/l + than hoạt tính 1 g/l + agar 5,5 g/l + nước dừa 150 ml/l để đánh giá tỷ lệ nảy mầm của hạt. CT đối chứng là môi trường không bổ sung khoáng đa lượng và vi lượng. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt
Công thức
(CT) Môi trường Tỷ lệ nảy mầm của hạt (%) 4 tuần 8 tuần 12 tuần CT 1 Đ/c 3,97 ± 0,8 18,17 ± 1,3 22,33 ± 1,64
CT 2 MS 41,77 ± 1,8 67,57 ± 1,4 84,7 ± 2,3 CT 3 B5 37,2 ± 1,45 55,57 ± 1,96 71,93 ± 1,8
CT 4 WPM 28,07 ± 1,3 41,5 ± 1,5 62,93 ± 1,9 Kết quả bảng số liệu 3.2 cho thấy, môi trường nền khác nhau có ảnh hưởng khác nhau tới sự nảy mầm của hạt
Sau 4 tuần theo dõi, tỷ lệ nảy mầm của hạt lan là rất thấp. Ở công thức đối chứng tỷ lệ nảy mầm chỉ đạt 3,97 %. Sau 8 tuần ở hầu hết các công thức đều có hiện tượng nảy mầm, tuy nhiên tỷ lệ nảy mầm chưa cao. Môi trường cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất sau 8 tuần đạt 67,57% là môi trường MS.
Sau 12 tuần theo dõi, tỷ lệ nảy mầm của hạt ở tất cả các công thức đã tăng lên rõ rệt, đặc biệt là công thức 2 (môi trường MS) với thành phần môi trường
giàu dinh dưỡng cho tỷ lệ nảy mầm đạt 84,7%, chất lượng hạt nảy mầm tốt, đồng đều và khỏe. Ở công thức 3 cho tỷ lệ nảy mầm đạt 71,93%, chồi có mầu xanh, hạt nảy mầm khỏe nhưng không đồng đều so với công thức 2. Ở công thức 4 tỷ lệ này đạt tương ứng là 62,93%, chồi nảy mầm không đồng đều, có màu nâu nhạt.
Qua thí nghiệm trên chúng tôi cho rằng các nền môi trường MS, WPM, B5 đều có khả năng kích thích hạt nảy mầm và có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng nảy mầm của hạt, trong đó môi trường MS cho tỷ lệ nảy mầm của hạt đạt 84,7%, cao hơn các nền môi trường còn lại, điều đó cho thấy hạt lan thích hợp nảy mầm trong môi trường giàu dinh dưỡng.
ĐC Môi trường MS
Hình 3.1: Ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt sau 12 tuần 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp
3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA tới khả năng nhân nhanh chồi lan hài Hài Giáp
BA (6 - Benzylaminopurine) là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong môi trường nuôi cấy mô nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan,
gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ [2]. Thí nghiệm được thực hiện nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh của lan Hài Giáp. Kết quả của thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.3
Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA tới khả năng nhân nhanh lan Hài Giáp
Công thức ( CT) Nồng độ BA (mg/l) Hệ số nhân (lần) Chiều cao
chồi Chất lượng chồi Sau 6 tuần CT 1 0 1,1 ± 0,17 1,88 ± 0,06 Chồi nhỏ, xanh nhạt CT 2 1 1,6 ± 0,07 1,54 ± 0,08 Chồi nhỏ, xanh đậm CT 3 2 2,24 ± 0,18 1,32 ± 0,04 Chồi mập, xanh đậm CT 4 3 1,95 ± 0,06 1,5 ± 0,031 Chồi mập, xanh đậm CT 5 5 1,37 ± 0,08 1,24 ± 0,06 Chồi nhỏ, xanh nhạt Sau 12 tuần CT 1 0 1,57 ± 0,14 1,97 ± 0,04 Chồi nhỏ, xanh nhạt CT 2 1 1,9 ± 0,13 1,99 ± 0,06 Chồi nhỏ, xanh đậm CT 3 2 2,41 ± 0,08 1,93 ± 0,05 Chồi mập, xanh đậm CT 4 3 2,5 ± 0,16 1,96 ± 0,03 Chồi mập, xanh đậm CT 5 5 1,87 ± 0,1 1,53 ± 0,09 Chồi nhỏ, xanh nhạt
Sau 6 tuần nuôi cấy khi bổ sung BA vào môi trường nền, hệ số nhân chồi tăng lên tỷ lệ thuận với hàm lượng BA (0 – 3mg/l). Ở tất cả các công thức có bổ sung BA đều cho hệ số nhân chồi cao hơn so với công thức đối chứng. Ở công thức CT 1 hệ số nhân chồi chỉ đạt 1,1 lần. Hệ số nhân cao nhất đạt 2,24 lần (CT 3), tiếp tục tăng nồng độ BA lên 5 mg/l hệ số nhân có xu hướng giảm còn 1,37 lần, chất lượng chồi kém.
Sau 12 tuần theo dõi hệ số nhân chồi của các công thức tăng theo thời gian nuôi cấy. Khi tăng nồng độ BA từ 0 – 3 mg/l hệ số nhân chồi tăng từ 1,57 lần lên 2,5 lần, đặc biệt là công thức 4 ở nồng độ 3 mg/l cho hệ số nhân cao nhất đạt 2,5 lần. Có thể thấy CT 3 và CT 4 là hai công thức tốt nhất trong thí nghiệm 3. Cả 2 công thức đều cho chất lượng chồi tốt, CT 4 cho hệ số nhân chồi cao hơn CT 3 sau 12 tuần theo dõi, tuy nhiên sự sai khác này không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Bên cạnh đó, sử dụng CT 3 sẽ giúp hạn chế lượng BA bổ sung vào môi trường, giảm được khả năng tạo biến dị không mong muốn, đồng thời tiết kiệm kinh phí cho thí nghiệm hơn so với CT4.
Ở chỉ tiêu chiều cao chồi, khi bổ sung BA chiều cao chồi giảm dần so với công thức đối chứng (không bổ sung BA). Chiều cao chồi giảm từ 1,90 cm (CT2) đến 1,53 cm (CT5), trong khi công thức đối chứng chồi đạt chiều cao là 1,97 cm. So sánh hai mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis (công thức đối chứng và công thức 2). Kết quả phân tích cho thấy sự sai khác về chiều cao chồi là không có ý nghĩa, độ tin cậy 95%. Do đó, lựa chọn công thức đối chứng hoặc công thức 2 đều cho sự sinh trưởng của chồi tốt.
Chất lượng chồi ở thí nghiệm được đánh giá từ mức kém đến mức tốt. Trong đó, CT 2 và CT 5 (nồng độ BA là 1 mg/l, 5 mg/l) có sự sai khác về chất lượng chồi là không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, ở công thức đối chứng khi không bổ sung BA cho chất lượng chồi kém nhất; công thức 3 và 4 cho chồi chất lượng cao hơn đối chứng và được đánh giá ở mức tốt.
Phân tích phương sai một nhân tố kết quả cho thấy F > F crit. Vì vậy, số chồi/mẫu ở các công thức khác nhau là do khác nhau về hàm lượng BA bổ sung