Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch

HgCl2 0,1 % đến quả lan Hài Giáp

Trong quá trình nuôi cấy in vitro vô trùng mẫu là giai đoạn khở i đầu và quyết đi ̣nh sự thành công của quá trình nuôi cấy. Để có được vật liệu khởi đầu sạch nấm và vi khuẩn, việc lựa chọn chất khử trùng, nồng độ, thời gian rất quan trọng. Trong quá trình nghiên cứu và tìm hiểu khả năng tạo mô sạch trong nuôi cấy in vitro trên đối tượng Phong lan nói chung và lan Hài nói riêng, chúng tôi nhận thấy có nhiều nhất chất hóa học có hoạt tính diệt nấm và vi khuẩn mạnh như Calcium hypochlorid Ca(OCl)2, thuỷ ngân clorua (HgCl2), hydroxid (H2O2),....Tuy nhiên HgCl2 được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng bởi chúng có hoạt tính khử trùng tốt, cho tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao [19]. Vì vâ ̣y trong đề tài này chúng tôi chọn HgCl2 ở nồng độ 0,1% với các mức thời gian khử trùng khác nhau để tạo vâ ̣t liê ̣u nuôi cấy vô trùng. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% đến quả lan Hài Giáp

Công thức (CT) Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ bình mẫu sống không nhiễm (%) Tỷ lệ bình mẫu sống nhiễm (%) Tỷ lệ bình mẫu chết (%) CT 1 0 0 100 0 CT 2 2 45,94 ± 2,4 43,88 ± 2,2 10,18 ± 2,7 CT 3 5 71,78 ± 1,3 16,72 ± 1,8 11,5 ± 1,3 CT 4 8 61,16 ± 1,1 15,92 ± 1,5 22,92 ± 0,9 CT 5 10 54,22 ± 1,8 13,64 ± 0,8 32,14 ± 1,6

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy:

Xét về chỉ tiêu bình mẫu sống không nhiễm, chúng tôi nhận thấy thời gian khử trùng có ảnh hưởng rõ rệt tới chỉ tiêu này. Ở nồng độ HgCl2 0,1% từ CT3 đến CT4 tương ứng với thời gian khử trùng từ 5 đến 8 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất. Ở CT3 tỷ lệ bình mẫu sống không nhiễm đạt 71,78%. Tuy nhiên khi thời gian khử trùng tăng lên 10 phút tỷ lệ bình mẫu sống không nhiễm giảm xuống còn 54,22%.

Xét về chỉ tiêu bình mẫu sống nhiễm, ở công thức đối chứng khi không sử dụng chất khử trùng toàn bộ hạt sẽ bị nhiễm sau 15 ngày theo dõi. Khi tăng thời gian khử trùng từ 2 phút lên 10 phút tỷ lệ bình mẫu sống nhiễm giảm từ 43,88 % xuống còn 13,64%, đồng thời tỷ lệ bình mẫu chết tăng lên từ 10,18% lên 32,14%. Điều này được giải thích rằng: Khi khử trùng mẫu bằng HgCl2 ở mô ̣t nồ ng đô ̣ nhất đi ̣nh, thời gian khử trùng càng dài khả năng tiêu diê ̣t vi khuẩn, nấm càng tăng do đó tỷ lệ mẫu nhiễm càng giảm. Tuy nhiên HgCl2 là loại hoá chất có khả năng gây độc và làm chết mẫu nên thời gian khử trùng mẫu càng dài và nồng đô ̣ chất khử trùng càng cao thì hoá chất khử trùng sẽ ngấm vào mẫu càng nhiều và làm tăng tỷ lệ mẫu chết.

Chúng tôi đã sử dụng phương pháp so sánh mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis. Kết quả phân tích cho thấy tỉ lệ bình mẫu sống không nhiễm ở các công thức thực sự khác nhau ở độ tin cậy 95%. Sử dụng hàm Anova Single Factor phân tích phương sai một nhân tố (thời gian khử trùng trong HgCl2 0,1%) nhằm tìm nguyên nhân của sự sai khác trên, kết quả cho thấy F > F crit, do đó tỉ lệ bình mẫu sống không nhiễm ở các công thức khác nhau là do khác nhau về thời gian xử lí HgCl2 0,1%.

Vì vậy để khử trùng quả lan Hài Giáp được hiệu quả, chúng tôi lựa chọn công thức sử dụng cồn 70o kết hợp với HgCl2 0,1% trong 5 phút.

3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt lan Hài Giáp

Dương Tấn Nhựt và cs (2005) đã nhân giống thành công lan Hài Hồng (Paphiopedilum delentii) bằng phương pháp gieo hạt in vitro. Sau đó tái tạo chồi bằng cách gây vết thương trên các mầm thu được từ gieo hạt và nuôi cấy trên môi trường lỏng đã thu được hệ số nhân là 5,2 lần [37]; [38]. Dựa vào nền tảng đó, chúng tôi cũng mong muốn tìm ra được môi trường thích hợp để nhân giống loài lan Hài Giáp bằng phương pháp gieo hạt in vitro.

Thí nghiệm sử dụng các nền môi trường dinh dưỡng phổ biến gồm MS, B5, WPM để tiến hành gieo hạt. Hạt được nuôi cấy trên các môi trường nền khác nhau có bổ sung đường 30 g/l + than hoạt tính 1 g/l + agar 5,5 g/l + nước dừa 150 ml/l để đánh giá tỷ lệ nảy mầm của hạt. CT đối chứng là môi trường không bổ sung khoáng đa lượng và vi lượng. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2.

Bảng 3.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt

Công thức

(CT) Môi trường Tỷ lệ nảy mầm của hạt (%) 4 tuần 8 tuần 12 tuần CT 1 Đ/c 3,97 ± 0,8 18,17 ± 1,3 22,33 ± 1,64

CT 2 MS 41,77 ± 1,8 67,57 ± 1,4 84,7 ± 2,3 CT 3 B5 37,2 ± 1,45 55,57 ± 1,96 71,93 ± 1,8

CT 4 WPM 28,07 ± 1,3 41,5 ± 1,5 62,93 ± 1,9 Kết quả bảng số liệu 3.2 cho thấy, môi trường nền khác nhau có ảnh hưởng khác nhau tới sự nảy mầm của hạt

Sau 4 tuần theo dõi, tỷ lệ nảy mầm của hạt lan là rất thấp. Ở công thức đối chứng tỷ lệ nảy mầm chỉ đạt 3,97 %. Sau 8 tuần ở hầu hết các công thức đều có hiện tượng nảy mầm, tuy nhiên tỷ lệ nảy mầm chưa cao. Môi trường cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất sau 8 tuần đạt 67,57% là môi trường MS.

Sau 12 tuần theo dõi, tỷ lệ nảy mầm của hạt ở tất cả các công thức đã tăng lên rõ rệt, đặc biệt là công thức 2 (môi trường MS) với thành phần môi trường

giàu dinh dưỡng cho tỷ lệ nảy mầm đạt 84,7%, chất lượng hạt nảy mầm tốt, đồng đều và khỏe. Ở công thức 3 cho tỷ lệ nảy mầm đạt 71,93%, chồi có mầu xanh, hạt nảy mầm khỏe nhưng không đồng đều so với công thức 2. Ở công thức 4 tỷ lệ này đạt tương ứng là 62,93%, chồi nảy mầm không đồng đều, có màu nâu nhạt.

Qua thí nghiệm trên chúng tôi cho rằng các nền môi trường MS, WPM, B5 đều có khả năng kích thích hạt nảy mầm và có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng nảy mầm của hạt, trong đó môi trường MS cho tỷ lệ nảy mầm của hạt đạt 84,7%, cao hơn các nền môi trường còn lại, điều đó cho thấy hạt lan thích hợp nảy mầm trong môi trường giàu dinh dưỡng.

ĐC Môi trường MS

Hình 3.1: Ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt sau 12 tuần 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp

3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA tới khả năng nhân nhanh chồi lan hài Hài Giáp

BA (6 - Benzylaminopurine) là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong môi trường nuôi cấy mô nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan,

gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ [2]. Thí nghiệm được thực hiện nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh của lan Hài Giáp. Kết quả của thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.3

Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA tới khả năng nhân nhanh lan Hài Giáp

Công thức ( CT) Nồng độ BA (mg/l) Hệ số nhân (lần) Chiều cao

chồi Chất lượng chồi Sau 6 tuần CT 1 0 1,1 ± 0,17 1,88 ± 0,06 Chồi nhỏ, xanh nhạt CT 2 1 1,6 ± 0,07 1,54 ± 0,08 Chồi nhỏ, xanh đậm CT 3 2 2,24 ± 0,18 1,32 ± 0,04 Chồi mập, xanh đậm CT 4 3 1,95 ± 0,06 1,5 ± 0,031 Chồi mập, xanh đậm CT 5 5 1,37 ± 0,08 1,24 ± 0,06 Chồi nhỏ, xanh nhạt Sau 12 tuần CT 1 0 1,57 ± 0,14 1,97 ± 0,04 Chồi nhỏ, xanh nhạt CT 2 1 1,9 ± 0,13 1,99 ± 0,06 Chồi nhỏ, xanh đậm CT 3 2 2,41 ± 0,08 1,93 ± 0,05 Chồi mập, xanh đậm CT 4 3 2,5 ± 0,16 1,96 ± 0,03 Chồi mập, xanh đậm CT 5 5 1,87 ± 0,1 1,53 ± 0,09 Chồi nhỏ, xanh nhạt

Sau 6 tuần nuôi cấy khi bổ sung BA vào môi trường nền, hệ số nhân chồi tăng lên tỷ lệ thuận với hàm lượng BA (0 – 3mg/l). Ở tất cả các công thức có bổ sung BA đều cho hệ số nhân chồi cao hơn so với công thức đối chứng. Ở công thức CT 1 hệ số nhân chồi chỉ đạt 1,1 lần. Hệ số nhân cao nhất đạt 2,24 lần (CT 3), tiếp tục tăng nồng độ BA lên 5 mg/l hệ số nhân có xu hướng giảm còn 1,37 lần, chất lượng chồi kém.

Sau 12 tuần theo dõi hệ số nhân chồi của các công thức tăng theo thời gian nuôi cấy. Khi tăng nồng độ BA từ 0 – 3 mg/l hệ số nhân chồi tăng từ 1,57 lần lên 2,5 lần, đặc biệt là công thức 4 ở nồng độ 3 mg/l cho hệ số nhân cao nhất đạt 2,5 lần. Có thể thấy CT 3 và CT 4 là hai công thức tốt nhất trong thí nghiệm 3. Cả 2 công thức đều cho chất lượng chồi tốt, CT 4 cho hệ số nhân chồi cao hơn CT 3 sau 12 tuần theo dõi, tuy nhiên sự sai khác này không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Bên cạnh đó, sử dụng CT 3 sẽ giúp hạn chế lượng BA bổ sung vào môi trường, giảm được khả năng tạo biến dị không mong muốn, đồng thời tiết kiệm kinh phí cho thí nghiệm hơn so với CT4.

Ở chỉ tiêu chiều cao chồi, khi bổ sung BA chiều cao chồi giảm dần so với công thức đối chứng (không bổ sung BA). Chiều cao chồi giảm từ 1,90 cm (CT2) đến 1,53 cm (CT5), trong khi công thức đối chứng chồi đạt chiều cao là 1,97 cm. So sánh hai mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis (công thức đối chứng và công thức 2). Kết quả phân tích cho thấy sự sai khác về chiều cao chồi là không có ý nghĩa, độ tin cậy 95%. Do đó, lựa chọn công thức đối chứng hoặc công thức 2 đều cho sự sinh trưởng của chồi tốt.

Chất lượng chồi ở thí nghiệm được đánh giá từ mức kém đến mức tốt. Trong đó, CT 2 và CT 5 (nồng độ BA là 1 mg/l, 5 mg/l) có sự sai khác về chất lượng chồi là không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, ở công thức đối chứng khi không bổ sung BA cho chất lượng chồi kém nhất; công thức 3 và 4 cho chồi chất lượng cao hơn đối chứng và được đánh giá ở mức tốt.

Phân tích phương sai một nhân tố kết quả cho thấy F > F crit. Vì vậy, số chồi/mẫu ở các công thức khác nhau là do khác nhau về hàm lượng BA bổ sung vào môi trường. Nếu xét đồng thời các chỉ tiêu (số chồi/mẫu, chiều cao chồi và chất lượng chồi) thì chỉ tiêu số chồi/mẫu được coi là ưu tiên trong giai đoạn nhân nhanh. Do đó có thể kết luận: CT 3 (bổ sung BA 2 mg/l vào môi trường nền MS + đường sucrose 30 g/l + agar 5,5 g/l + 150 ml/l nước dừa) là thích hợp nhất trong

thí nghiệm, cho số chồi/mẫu đạt 2,41 chồi, sự sinh trưởng của chồi đảm bảo, chất lượng chồi tốt.

Tác giả Nguyễn Thị Cúc và cs (2014) đã kết luận nồng đô ̣ BA thích hợp nhất cho nhân nhanh chồ i củ a lan hài P. delenatii khi nuôi cấy trên môi trườ ng MS là 2 mg/l, tỷ lê ̣ đạt 75% sau 30 ngày nuôi cấy [3]. So sánh kết quả nghiên cứu của chú ng tôi với kết quả nghiên cứu của tác giả trên thấy kết quả nghiên cứu của tôi hoàn toàn phù hơ ̣p. Điều này chứng tỏ BA có tác du ̣ng tích cực trong việc nhân nhanh chồ i lan Hài nói chung và kích thích nhân nhanh chồi lan Hài Giáp nói riêng. Vì vậy công thức bổ sung BA nồng độ 2 mg/l vào môi trường nền được chọn để sử dụng trong nghiên cứu các thí nghiệm nhân nhanh tiếp theo (BA kết hợp với NAA).

Hình 3.2: Ảnh hưởng của BA tới khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp

A: 0 mg/l (Đ/c) C: 5 mg/l BA E: 2 mg/l BA B: 1 mg/l BA D: 3 mg/l BA

3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA tới khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy mô. Đối với sự phát sinh phôi, sự tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và

chồi nách [9]. Theo Chyuam và cs (2011) thì số lượng chồi của lan Hài lai tăng gấp hai lần sau 12 tuần nuôi cấy khi môi trường có bổ sung BA và NAA [26].

Thí nghiệm được thực hiện nhằm nghiên cứu sự ảnh hưởng của việc bổ sung đồng thời hai chất kích thích sinh trưởng thực vật BA (thuộc nhóm cytokinin) và NAA (thuộc nhóm auxin) vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh lan Hài Giáp. CT đối chứng là môi trường nền có bổ sung đường 30 g/l + than hoạt tính 1 g/l + agar 5,5 g/l + nước dừa 150 ml/l, các CT thí nghiệm còn lại có hàm lượng BA cố định là 2 mg/l, đồng thời bổ sung NAA tăng từ 0,1 – 1 mg/l. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.4.

Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA tới khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp

Công thức ( CT) Nồng độ NAA (mg/l) Hệ số nhân (lần) Chiều cao chồi (cm) Chất lượng chồi Sau 6 tuần CT 1 0 1,23 ± 0,07 1,54 ± 0,12 Chồi nhỏ, xanh nhạt CT 2 0,1 2,01 ± 0,1 1,65 ± 0,09 Chồi mập,xanh nhạt CT 3 0,3 2,61 ± 0,06 1,8 ± 0,04 Chồi mập, xanh đậm CT 4 0,5 2,45 ± 0,09 1,85 ± 0,06 Chồi mập,xanh đậm CT 5 1 2,1 ± 0,07 1,91 ± 0,1 Chồi nhỏ, xanh nhạt Sau 12 tuần CT 1 0 1,92 ± 0,07 2,02 ± 0,09 Chồi nhỏ, xanh nhạt CT 2 0,1 2,8 ± 0,17 2,16 ± 0,1 Chồi mập,xanh nhạt CT 3 0,3 3,16 ± 0,15 2,22 ±0,07 Chồi mập,xanh đậm CT 4 0,5 3,28 ± 0,09 2,19 ± 0,14 Chồi mập,xanh đậm CT 5 1 2,62 ± 0,16 2,32 ± 0,13 Chồi nhỏ, xanh nhạt

Qua bảng 3.4 chúng tôi nhận thấy:

Sau 6 tuần theo dõi ở công thức 3 khi bổ sung NAA 0,3 mg/l kết hợp với BA 2 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 2,61 lần; chiều cao chồi đạt 1,8 cm.

Sau 12 tuần theo dõi hệ số nhân chồi tăng lên đáng kể khi bổ sung đồng thời BA và NAA vào môi trường. Hệ số nhân chồi tăng hơn hẳn so với công thức đối chứng, tăng từ 1,92 lần lên 3,28 lần. Đặc biệt cùng với mức BA (2 mg/l), khi tăng nồng độ NAA lên 0,3 mg/l (CT3), 0,5 mg/l (CT4) thì hệ số nhân chồi tăng dần lần lượt là 3,16 lần và 3,28 lần. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng hàm lượng NAA thì hệ số nhân chồi có xu hướng giảm xuống còn 2,62 lần (CT 5 1mg/l). Khi tăng nồng độ NAA, chỉ tiêu chiều cao chồi có sự thay đổi nhưng không đáng kể so với CT đối chứng tuy nhiên chất lượng chồi xấu đi nguyên nhân là do nồng độ NAA cao gây độc cho mẫu.

Từ những nhận xét trên chúng tôi thấy, CT3 và CT4 là 2 công thức tốt nhất trong thí nghiệm. Mặc dù CT4 có giá trị hệ số nhân cao hơn CT3, tuy nhiên khi sử dụng phương pháp so sánh hai mẫu độc lập giữa CT 3 và CT 4 thì sự sai khác này không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 0,05. Bên cạnh đó CT3 cho chỉ tiêu chiều cao chồi và chất lượng chồi tốt hơn. Đồng thời sử dụng CT3 sẽ giúp giảm lượng NAA sử dụng trong thí nghiệm do đó làm giảm chi phí ban đầu. Hệ số nhân chồi này có phần cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Huang và cs (2000) [29], đồng thời tương tự với các kết quả nghiên cứu của Chen và cộng sự (2004a) cho thấy rằng trong nhiều trường hợp lan Hài hình thành chồi ít hơn so với các loại hoa lan khác [24].

Từ đó đưa ra kết luận công thức 3 bổ sung BA 2 mg/l + NAA 0,3 mg/l NAA vào môi trường nền MS cho hệ số nhân chồi cao đạt 3,16 lần; chiều cao chồi đạt