Trong luận án này, hoạt tính kháng khuẩn của các vật liệu được khảo sát đánh giá tại Viện Cơng nghệ Mơi trường - Viện Hàn lâm KHCNVN bằng các phương pháp khác nhau: đục lỗ thạch, pha lỗng nồng độ, tiếp xúc trực tiếp [76, 77, 90].
a) Phương pháp đục lỗ thạch
Nguyên tắc của phương pháp đục lỗ thạch là xác định khả năng khuếch tán của chất thử vào lớp thạch, gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh vị trí cĩ chất thử. Đường kính vịng vơ khuẩn càng lớn thì tác dụng kháng khuẩn càng mạnh.
Cách tiến hành như sau:
- Mơi trường nuơi cấy vi khuẩn được chuẩn bị, hấp khử trùng và đổ vào các đĩa petri với thể tích khoảng 15ml để tạo mặt thạch.
- Cấy các chủng vi khuẩn thử nghiệm vào mơi trường tăng sinh vi khuẩn đã được khử trùng. Ủ ở 370C trong thời gian từ 6 – 8h để các chủng vi khuẩn hoạt hĩa và tăng sinh. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sĩng 625 nm. Độ đục của vi khuẩn phải trong khoảng từ 0,08 đến 0,1 để tương ứng với mật độ vi khuẩn khoảng 1 – 2 x 108
CFU/mL.
- Hút chính xác 100 µL dung dịch vi khuẩn đã chuẩn bị cho vào đĩa petri chứa mơi trường nuơi cấy vi khuẩn, trải đều lên trên mặt thạch, sau đĩ tiến hành đục những lỗ thạch. Hút chính xác 100 µL các chất thử nghiệm cho vào các lỗ thạch. Ủ các đĩa petri trong 24 giờ ở nhiệt độ 37°C.
- Quan sát vịng kháng khuẩn và đánh giá kết quả.
b) Phương pháp pha lỗng nồng độ
Phương pháp pha lỗng nồng độ là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật của mẫu thử thơng qua độ đục của mơi trường nuơi cấy. Các giá trị thể hiện hoạt tính là IC50 (50% Inhibitor Concentration- nồng độ ức chế 50%), MIC (Minimum Inhibitor Concentration- nồng độ tối thiểu ức chế),
Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm những vi khuẩn Gram (+) (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Lactobacillus fermentum), khuẩn Gram (-) (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica) và nấm Candida albicans.
Cách tiến hành như sau:
- Mẫu thử được pha lỗng thành một dãy 4 đến 10 nồng độ.
- Vi sinh vật kiểm định được hoạt hĩa bằng mơi trường nuơi cấy sao cho nồng độ đạt 5x105 CFU/mL.
- Lấy 10µl dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 190 µl dung dịch vi sinh vật đã được hoạt hĩa ở trên, ủ ở 37o
C trong 24 giờ.
- Xác định MIC: bổ sung 50 l [3-(4,5-dimetylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetra zolium bromit] (MTT) (1 mg/mL) vào các giếng thử và đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng cĩ nồng độ chất thử thấp nhất khơng chuyển hĩa MTT thành MTT formazan cho màu tím đậm
- Giá trị IC50 được xác định thơng qua giá trị % ức chế vi sinh vật phát triển và phần mềm máy tính Rawdata.
% ức chế tế bào = (ODchứng (+) – ODmẫu thử)/( ODchứng (+)– ODchứng (-)) x 100%
(2.4)
(Trong đĩ, HighConc/LowConc: chất thử ở nồng độ cao/chất thử thấp ở nồng độ thấp; HighInh%/LowInh%: % ức chế ở nồng độ cao/% ức chế ở nồng độ thấp).
c) Phương pháp tiếp xúc trực tiếp
Hoạt tính của vật liệu kháng khuẩn được khảo sát đánh giá theo phương pháp tiếp xúc trực tiếp được tiến hành như sau:
- Vi khuẩn được cấy và nhân lên qua đêm để đạt được mật độ khoảng 107 CFU/mL - Cân vật liệu khử khuẩn với khối lượng phù hợp với nồng độ muốn thử, cho vào cốc thủy tinh chứa 198 mL nước cất. Cho thêm 2 mL dịch vi khuẩn, khuấy 300 vịng/phút trong một thời gian nhất định.
- Sau thời gian tiếp xúc xác định, tách loại vật liệu khử khuẩn. Định lượng số vi sinh vật cịn lại trong dung dịch bằng phương pháp pha lỗng theo dãy thập phân trong nước muối sinh lý 0,85%: Đổ đĩa mơi trường, ủ ở 37o
C trong 24 giờ. Đếm số vi sinh vật cịn lại và tính hiệu lực diệt khuẩn theo cơng thức:
H (%) = (1- N
A) x 100% (2.5) Trong đĩ: A là mật độ vi khuẩn ban đầu;
N là mật độ vi khuẩn sau tiếp xúc. Mỗi mật độ pha lỗng lặp lại 3 lần thí nghiệm.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN