Phương pháp nghiên cứu

Các bước thí nghiệm của luận án được tiến hành như sau: Sàng lọc chủng vi sinh vật có khả năng tạo biofilm tốt

Thử nghiệm tính đối kháng của các chủng vi sinh vật Đánh giá khả năng hình thành biofilm

của hỗn hợp chủng vi sinh vật trên các vật liệu mang

Đánh giá khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon của biofilm hỗn hợp chủng vi sinh vật trên các vật liệu mang

ở quy mô 50 lít

Đánh giá khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon của biofilm hỗn hợp chủng vi sinh vật trên các vật liệu mang ở

quy mô 300 lít

Định danh và nghiên cứu con đường chuyển hóa sec- hexylbenzene của biofilm chủng Trichosporon sp. B1

Đánh giá khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon của biofilm hỗn hợp chủng vi sinh vật trên vật liệu mang ở quy mô 20m3

Hình 2.2. Sơ đồ các bước thí nghiệm thực hiện trong luận án

2.2.1. Nhóm phương pháp nghiên cứu vi sinh vật

2.2.1.1. Đánh giá khả năng tạo biofilm của vi sinh vật

Khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật được đánh giá theo phương pháp của O’Toole và cs [50]. Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường lỏng MPA đối với vi khuẩn và Hansen đối với nấm men. Sau 16 giờ nuôi, ly tâm 1 ml loại dịch và thu sinh khối (ly tâm ở 4.000 rpm, 4oC trong vòng 10 phút, lặp lại 3 lần để loại bỏ hoàn toàn môi trường nuôi cấy). Đánh tan sinh khối trong 1 ml nước cất vô trùng và tiến hành pha loãng để đạt OD600 là 0,3. Bổ sung 3 μl dịch này vào các ống eppendorf 1,5 ml chứa 297 μl môi trường MPA (đối với vi khuẩn) và môi trường Hansen (đối với nấm men). Cứ sau 24h lấy các ống eppendorf chứa mẫu nuôi để đánh giá khả năng tạo biofilm (mỗi chủng tương ứng với 3 ống eppendorf cho mỗi ngày trong 3 ngày liên tiếp). Dùng pipetman hút nhẹ dịch nuôi, rửa bằng

29

500μl nước cất vô trùng lặp lại trong 2 lần. Tiếp đó, bổ sung 300 μl dung dịch tím kết tinh 0,1% vào các ống eppendorf, cố định 10 phút ở nhiệt độ phòng và rửa 2 lần bằng nước cất vô trùng. Sau đó bổ sung 300 μl dung dịch acetic acid 33% trộn đều rồi pha loãng và đo OD ở bước sóng 570 nm. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

2.2.1.2. Kiểm tra tính đối kháng của các chủng vi sinh vật

Tính đối kháng của các chủng vi khuẩn và tính đối kháng của các chủng nấm men được thực hiện theo mô tả của Nguyễn Lân Dũng và cs [98]. Cấy vạch các chủng vi sinh vật lên môi trường thạch đĩa MPA/Hansen cho các vạch cấy cắt nhau từng cặp một, nuôi ở 30oC trong 24h. Sự đối kháng của 2 chủng vi sinh vật thể hiện qua dấu hiệu gián đoạn tại các vị trí giao nhau của 2 vạch cấy.

2.2.1.3. Đánh giá mật độ tế bào vi sinh vật

Mật độ tế bào vi sinh vật tổng số được xác định theo phương pháp MPN [99]. Sinh khối vi sinh vật được hòa tan trong nước cất vô trùng. Sau đó 1ml sinh khối được hòa tan trong 9ml nước muối sinh lý vô trùng và tiếp tục pha loãng ở các nồng độ tới hạn. Tiếp đó ở mỗi nồng độ pha loãng, tiến hành hút 1ml vào 5 ống nghiệm chứa 9ml môi trường hỗn hợp MPA/Hansen. Tất cả các ống nghiệm được nuôi ở tủ ấm 30oC đến khi xuất hiện hiện tượng đục môi trường. Tiến hành ghi nhận số lượng các ống dương tính (xuất hiện hiện tượng đục môi trường) ở 3 nồng độ pha loãng thấp nhất và tra bảng MacGrady để xác định kết quả. Tính mật độ tế bào bằng công thức:

CFU/ml = (Kết quả tra bảng Macgrady)*(f/10) Trong đó:

f: là độ pha loãng thấp nhất được chọn (10n)

2.2.1.4. Phân loại và định tên nấm men

Chủng nấm men B1 có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường sec-

hexylbenzene được tiến hành phân loại và định tên bằng phương pháp so sánh trình tự đoạn ITS1 với các chủng nấm men khác trên ngân hàng gene (NCBI). Quá trình thực hiện được triển khai như sau:

Tách chiết DNA tổng số: DNA tổng số của nấm men được tách chiết theo phương pháp của Harju và cs [100], các bước được tiến hành như sau:

- Bước 1: Nuôi cấy tế bào nấm men trong môi trường YPD lỏng (1% cao men, 2% peptone, 2% dextrose) ở 30oC trong 18h. Thu sinh khối bằng cách ly tâm

6000 vòng/phút trong 10 phút.

- Bước 2: Bổ sung 200 µl Harju Buffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA) sau đó vortex nhẹ. Ủ mẫu trong - 80oC trong 2 phút cho tới khi đông hoàn toàn, sau đó thả nhanh vào nước ở 95o C trong 1 phút. Quá trình này được lặp lại 2 lần.

- Bước 3: Bổ sung 200 µl chloroform, đảo nhẹ và ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút. Bổ sung 400 µl ethanol 100% lạnh ở -20oC để tủa DNA trong 2h. - Bước 4: Ly tâm 12000 vòng trong 15 phút để thu tủa. Bổ sung 300 µl cồn 70oC và ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút để rửa tủa

- Bước 5: Làm khô tủa và hòa tan trong 25 µl nước deion vô trùng.

Nhân đoạn gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 bằng phương pháp PCR:

- Cặp mồi sử dụng: ITS1: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’ và

ITS4: 5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ [101].

- Thành phần phản ứng PCR: Hỗn hợp phản ứng PCR (25 µl) gồm DNA khuôn

(5-10 ng), DNA polymerase (taq polymerase 5 unit/l), các nucleotit (dNTPs), dung dịch đệm và 2 đoạn mồi. Hỗn hợp phản ứng (25l) gồm các thành phần như sau:

Buffer Taq 10x MgCl2 25mM dNTPs 2,5mM DNA khuôn

Chu trình nhiệt độ được sử dụng như sau: Bước 1: Bước 2: Bước 3: Bước 4: Bước 5: Bước 6: Bước 7:

Sau khi nhân được đoạn gen với kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết, sản phẩm PCR được tinh sạch theo quy trình hướng dẫn của bộ kit Gel Purification Kit (hãng BIONEER). Các bước tiến hành như sau:

sản phẩm PCR (tương ứng với 100 µl PCR Binding buffer). Hòa tan cho đến khi tan hoàn toàn. Chuyển hỗn hợp sang ống eppendorf chứa cột DNA binding và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.

- Bước 2: Bỏ dịch, chuyển cột sang ống eppendorf mới và bổ sung 300 μl đệm rửa vào ống eppendorf chứa cột DNA binding và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Lặp lại bước này 2 lần. Làm khô cột chứa DNA bám trên cột bằng cách ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.

- Bước 3: Bổ sung 30μl đệm thôi DNA vào giữa cột, đợi 1 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột, thu dịch và bảo quản mẫu ở 4oC.

Xác định trình tự và so sánh trình tự gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 của chủng nấm men với các chủng nấm men khác: Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch và được gửi xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3.100 Avant Genetic Analyzer theo phương pháp của Sanger. Trình tự nucleotide được xử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3.100 Avant Collection v 1.0 và trình tự DNA đó được so sánh với trình tự của các chủng vi khuẩn/nấm men khác chuẩn trong danh sách các chủng vi sinh vật prokaryote chuẩn (List of prokaryotic names with standing in nomenclature – LPSN) và ngân hàng gen thế giới (National Center for Biotechnology Information – NCBI).

Định tên và xây dựng cây phát sinh chủng loại của chủng vi sinh vật: Trình tự gen mã hóa ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 được xử lý bằng các phần mềm Clustal X và Mega4 để xây dựng cây phát sinh chủng loại. Trình tự đoạn gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 của chủng nấm men được đăng ký trên ngân hàng dữ liệu gen thế giới NCBI và ngân hàng dữ liệu gen Nhật Bản (DNA Data Bank of Japan – DDBJ).

2.2.2. Nhóm phương pháp phân tích hóa học

2.2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng dầu tổng số trong nước thải

Lượng dầu tổng số trong nước thải được xác định bằng phương pháp phân tích khối lượng theo tiêu chuẩn TCVN 5070:1995. Tiến hành thu thập 20ml mẫu, hòa tan mẫu trong 3 ml dung môi chloroform và lắc nhẹ trong 10 phút cho dầu tan hoàn toàn. Khi dầu và dung môi tách làm 2 lớp, dùng phễu chiết loại 60ml bỏ phần dung môi ở phía dưới. Phần dịch hòa tan còn lại được cô bay hơi trong bếp cát cho tới cạn và cân khối lượng dầu có trong 20 ml dung dịch. Xác định hàm lượng dầu tổng số trong nước thải theo công thức:

32 DTS (mg/l) = (X*1000)/20

Trong đó:

DTS: là lượng dầu tổng số trong nước thải X: là hàm lượng dầu có trong 20 ml mẫu (mg)

2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng các thành phần hydrocarbon trong nước thải nhiễm dầu

Tách chiết các thành phần hydrocarbon trong nước thải nhiễm dầu: Nước thải nhiễm dầu được thu thập và được tách chiết bằng dung môi hữu cơ acetone: etyl acetate theo tỷ lệ mẫu nước thải: dung môi là 1:3. Dịch tách chiết được làm khan bằng Na2SO4, tiến hành lọc và cô quay dung môi ở ấp suất thấp đến khi con 10 ml. Sau đó đem phân tích thành phần bằng sắc ký khí (GC), sắc ký khí kết hợp khối phổ (GCMS) và sắc ký lỏng hiệu năng (HPLC) tại Viện Hóa công nghiệp.

GC (Gas chromatography): Dịch chiết được phân tích bằng máy Shimadzu GC- 14° (Duisburg) với đầu dò đèn ion (FID). Nhiệt độ chạy: 5 phút ở 40oC; 1 phút/oC ở 40-60oC và 1 phút/10oC ở 60-300oC; dòng khí mang (He) 2ml/phút; nhiệt độ detector 310oC; nhiệt độ bơm đầu vào 250oC.

GCMS (Gas chromatography – mass spectra): Các dịch chiết xuất được phân tích bằng máy GCMS của hãng Shimadzu QP 2010, cột chạy DB-5 MS với đường kính trong là 0,25 mm. Mẫu được phân tích với chương trình chạy như sau: nhiệt độ bơm mẫu đầu vào là 150oC, nhiệt độ cổng bơm 260oC, nhiệt độ chạy mẫu là 2oC/phút, tỷ lệ tăng 5oC/phút đến 200oC sau đó tăng 15oC/phút và tăng đến 300 oC giữ trong 10 phút, trọng lượng phổ nằm trong khoảng 50-500, nhiệt độ chuyển dòng là 230oC và nhiệt độ nguồn ion là 230oC.

HPLC (high-performance liquid chromatography): Dịch chiết xuất được phân tích HPLC trên máy Hewlett-Packard (Bad Homburg, Germany). Nhờ hệ thống LiChroCart 125-4 RP-18 end-capped (5-μm) column (Merck, Darmstadt, Germany) các sản phẩm của quá trình chuyển hoá các thành phần dầu mỏ sẽ được phân tách. Nồng độ dung môi chạy mẫu ban đầu bao gồm 30 % methanol-70 % phosphoric acid (0,1 %), sau 14 phút thì đạt 100 % methanol, tốc độ dòng chảy 1 ml/phút.

2.2.2.3. Nghiên cứu con đường chuyển hóa sec-hexylbenzene của B1

Chủng nấm men B1 được nuôi cấy trong môi trường Malt (ME) sử dụng chai download by : skknchat@gmail.com

thủy tinh 500ml, nuôi tĩnh ở 30oC trong 48h để tạo biofilm trên bề mặt môi trường. Sau đó tiến hành rút nhẹ môi trường lỏng để lại phần biofilm, rồi rửa nhẹ 2 lần bằng môi trường YMM, sau đó cấy vào môi trường YMM chứa 100ppm sec-

hexylbenzene, nuôi cấy trong 3 ngày ở 30oC. Thí nghiệm đối chứng được thực hiện với môi trường YMM chứa 100ppm sec-hexylbenzene và không bổ sung vi sinh vật. Mẫu được thu thập ở 0, 2, 4, 8, 24, 30 và 48h nuôi cấy để phân tích các sản phẩm tạo thành sử dụng sắc ký khí kết hợp khối phổ (GCMS) và sắc ký lỏng hiệu năng (HPLC) tại Viện Hóa công nghiệp, Bộ Công thương.

2.2.3. Đánh giá khả năng hình thành biofilm của hỗn hợp chủng vi sinh vật trên vật liệu mang

2.2.3.1. Xử lý sơ bộ vật liệu mang

Nguyên liệu xơ dừa được ngâm trong nước máy trong 2-3 ngày để loại bỏ tanin, sau đó rửa lại bằng nước máy 3 lần. Tiếp tục ngâm trong NaOH 0,1M trong 5- 7 ngày để loại bỏ lignin.

Tiếp đó các vật liệu xơ dừa, cellulose và mút xốp được phơi khô sau đó cắt thành các tấm có kích thước 34*25*4cm. Tiến hành khử trùng ướt vật liệu ở 121oC, 1 atm trong 20 phút sau đó sấy khô.

Đối với sỏi nhẹ được xử lý loại màu bằng cách ngâm trong Ca(OH)2 loãng (0,5 kg vôi/20 lít nước) trong 5-7 ngày, sau đó rửa 2-3 lần bằng nước sạch. Vật liệu tiếp tục được khử trùng khô ở 80oC trong 30 phút. Sau đó được đổ vào module chứa vật liệu mang để tiến hành thí nghiệm.

2.2.3.2. Thiết kế mô hình thí nghiệm

Mô hình thí nghiệm được thiết kế theo nguyên lý kỹ thuật biofilm tầng tĩnh được mô tả bởi Burghate & Ingole [102]. Mô hình thí nghiệm được thiết kế với dung tích 50 lít bao gồm 4 bộ phận: bể thủy tinh, 03 module vật liệu mang và hệ thống đảo trộn (hình 2.3).

Module vật liệu mang: dạng hình hộp chữ nhật được cấu tạo từ nhôm tĩnh điện, có lưới thép để cố định vật liệu mang bên trong. Tỷ lệ thể tích vật liệu mang: dung tích vận hành mô hình là 1:5.

Bể thủy tinh: được thiết kế dạng hình hộp chữ nhật, kích thước 40*40*50cm,

34 dung tích tối đa 80 lít.

Hình 2.3. Cấu tạo của mô hình thí nghiệm dung tích 50 lít

1. Bể kính; 2. Modul; 3. Lưới thép; 4. Đường ống; 5. Máy bơm

2.2.3.4. Tạo biofilm vi sinh vật trên vật liệu mang

Các chủng vi khuẩn và nấm men được nuôi lỏng, lắc trong môi trường HKTS đối với vi khuẩn và Hansen đối với nấm men ở 30oC và 37oC trong 18h. Tiếp đó tiến hành ly tâm thu sinh khối tế bào ở 6.000 vòng/phút đối với vi khuẩn và 4.000 vòng/phút đối với nấm men trong 10 phút, 4oC. Sinh khối được rửa bằng nước cất vô trùng 2 lần, rồi hòa tan trong 1 lít nước muối sinh lý vô trùng. Tiến hành bổ sung dịch sinh khối vi sinh vật và môi trường hỗn hợp HKTS:Hansen (6:4) vào mô hình sao cho được tổng thể tích 50 lít và giá trị OD600 là 0,3. Tiến hành nuôi tĩnh tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển và tạo biofilm trên vật liệu mang.

2.2.3.5. Xác định mật độ vi sinh vật trên vật liệu mang

1cm3 vật liệu mang được thu thập và lắc trong 4,5ml dung dịch đệm PBS (Phosphate buffer solution) trong 1h theo mô tả của Félix de Castro và cs [103], tiến hành pha loãng tới hạn và xác định mật độ vi sinh vật bằng phương pháp MPN. Việc xác định mật độ vi sinh vật trên vật liệu mang được tiến hành tại các thời điểm 18, 24 và 36 giờ nuôi cấy. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

2.2.3.6. Quan sát cấu trúc biofilm trên vật liệu mang trên kính hiển vi điện tử quét

Các mẫu vật liệu mang được tiến hành quan sát cấu trúc biofilm trên kính hiển vi điện tử quét Hitachi S-4800 tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương theo quy trình thực hiện như sau:

- Bước 1: 1 cm3 vật liệu mang được gắn (cố định) trên lá kính sạch, mỏng có gắn poly-L-lysine 0,1% (w/v) và cho vào eppendorf có chứa dung dịch cacodylate 0,1 M. - Bước 2: Cố định mẫu bằng 2,5-3% glutaraldehyte/cacodylate 0,1 M pH 7,2- 7,4 (1h hoặc qua đêm ở nhiệt độ 4oC).

- Bước 3: Rửa mẫu bằng dung dịch cacodylate 0,1M (5 phút/ lần x 3 lần).

- Bước 4: Cố định mẫu bằng OsO4 1% trong cacodylate 0,1 M trong 1h ở

nhiệt độ phòng.

- Bước 5: Rửa mẫu bằng dung dịch cacodylate 0,1 M (5 phút/lần x 2 lần).

- Bước 6: Hút nước trong mẫu bằng cồn các nồng độ 50o, 70o, 80o, 90o, 100o

(5 phút/lần x 2 lần).

- Bước 7: Chuẩn bị đế gắn mẫu sử dụng giấy bạc.

- Bước 8: Hòa loãng mẫu với nồng độ thích hợp trong cồn tuyệt đối, nhỏ

mẫu lên giấy bạc gắn sẵn trên đế, để khô hoàn toàn.

- Bước 9: Phủ mẫu bằng một lớp dẫn điện Pt – Pd và tiến hành soi mẫu

2.2.4. Đánh giá khả năng phân hủy dầu DO và hydrocarbon thơm của biofilm visinh vật trên vật liệu mang sinh vật trên vật liệu mang

2.2.4.1. Xử lý sơ bộ vật liệu và thiết kế mô hình thí nghiệm

Mô hình thí nghiệm dung tích 50 lít và xử lý sơ bộ vật liệu mang được thiết kế như mục 2.2.3, triển khai tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường,