3.6.1. Khả năng hình thành biofilm của chủng B1
Từ kết quả thử nghiệm khả năng hình thành biofilm của các chủng vi sinh vật được trình bày tại Hình 3.1 cho thấy, sau 24h chủng B1 có khả năng hình thành biofilm rất tốt trên bề mặt ống effendorf. Khả năng hình thành biofilm của chủng B1 cao hơn nhiều so với chủng Acinetobacter calcoaceticus P23 được lựa chọn là chủng đối chứng dương với giá trị ∆OD570 đạt 19,71 (Đối chứng dương 11,04).
73
Kết quả nuôi cấy trên môi trường ghost có bổ sung các thành phần hydrocarbon, cho thấy chủng B1 có khả năng sinh trưởng tốt trên nhiều nguồn hydrocarbon khác nhau bao gồm n-alkane từ C11 đến C22, các thành phần hydrocarbon thơm như phenol và PAH, đặc biệt có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường chứa sec-hexylbenzene là chất có cấu trúc vòng chứa mạch nhánh khó phân hủy trong tự nhiên, tồn tại khá phổ biến trong nước thải nhiễm dầu tại các kho xăng dầu, vùng bị ô nhiễm dầu.
3.6.2. Kết quả định danh chủng B1
Chủng nấm men B1 được phân loại sơ bộ bằng hình thái và bằng Kit chuẩn sinh hóa API 20 C AUX theo mô tả của Maria và cs [110], các dữ liệu định danh được so sánh trong cơ sở dữ liệu được mô tả bởi Barnett và cs [111] và Kreger Van Rij [112], kết quả được trình bày ở Bảng 3.18, Hình 3.29.
Chủng B1 có đặc điểm khuẩn lạc màu trắng, tròn, lồi, nóng ướt, đường kính khuẩn lạc từ 1,2-1,7mm. Dưới độ phóng đại 7000 lần, tế bào chủng B1 có hình quả chanh, kích thước khoảng 3,5*5µm. Dựa vào các đặc điểm hình thái tế bào và khuẩn lạc của chủng B1, đồng thời dựa trên kết quả phân loại sơ bộ bằng các Kít chuẩn sinh hóa, chủng B1 được xác định thuộc chi Trichosporon.
(a) (b)
Hình.3.29. Hình thái khuẩn lạc (a) và hình thái tế bào của chủng B1 (b)
Bảng 3.18. Kết quả phân loại bằng Kit chuẩn sinh hóa API 20 C AUX của chủng B1
TT 1 2 3 4 5 download by : skknchat@gmail.com
TT 6 7 8 9 10 11
(-, âm tính; -+, đổi màu khoảng 15-25%; +-, đổi màu khoảng 25-35%; +, dương tính) Chủng B1 tiếp tục được giải trình tự đoạn gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 có kích thước 492bp và đăng ký trên ngân hàng Gene với mã số KC139404.
Trình tự đoạn gen được so sánh trên ngân hàng gen bằng công cụ BLAST, cho thấy chủng B1 là Trichosporon asahii với độ tương đồng là 100% với chủng
Trichosporon asahii (NR_073341).
Hình 3.30. Cây phát sinh chủng loại của chủng B1
3.6.3. Sự phân hủy sec-hexylbenzene của chủng Trichosporon asahii B1
Chủng nấm men B1 ở cả 2 dạng biofilm và dạng tế bào tự do được nuôi cấy trong môi trường YMM chứa 100ppm sec-hexylbenzene trong chai thủy tinh 500ml để nghiên cứu động học về chuyển hóa sec-hexylbenzene. Kết quả phân tích HPLC tìm kiếm các chất trung gian cho thấy trong điều kiện tạo biofilm của chủng nấm men B1 phát hiện 5 sản phẩm chuyển hóa A, B, C, D và E có thời gian lưu lần lượt là 6,0; 7,8; 8,9; 9,4 và 13,8 phút. Trong khi đó ở điều kiện nuôi cấy dạng tế bào tự do của chủng nấm men B1 thì chỉ phát hiện 3 sản phẩm chuyển hóa bao gồm C, D và E ở các thời gian lưu 8,9; 9,4 và 13,8 phút (Hình 3.31).
75
(b) Sản phẩm D
[Grab your reader’s Sản phẩm C
attention with a great quote
Sản phẩm E
Sản phẩm Bfrom the document or use
Sản phẩm A this space to emphasize a key point. To place this text box anywhere on the page, just drag it.]
Hình 3.31. Sắc ký đồ của các sản phẩm trung gian tạo thành trong quá trình chuyển hóa của sec-hexylbenzene bởi chủng B1 ở dạng tế bào tự do (a) và dạng biofilm sau 48h (b) Để xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất trung gian này, mẫu thí nghiệm tiếp tục được tách chiết và phân tích bằng phương pháp GCMS. Các chất chuyển hóa trung gian được xác định bằng phương pháp so sánh thời gian lưu và phổ hấp phụ UV/Vis của phân tích HPLC đồng thời so sánh thời gian lưu, khối phổ của phân tích GCMS. Các sản phẩm tạo thành được so sánh về cấu trúc hóa học với các hợp chất có trong thư viện NIST và so sánh với chất chuẩn được mua để làm đối chứng.
Kết quả so sánh cho thấy sản phẩm A có thời gian lưu là 6,0 phút (HPLC) và 12,3 phút (GCMS). Phổ khối lượng cho thấy chất này có một đỉnh ion phân tử ở m/z 136 chứa các ion phân mảnh đặc trưng m/z 105 (100%), m/z 77 (75,3%) và m/z 51(29,1%), phù hợp với thời gian lưu và phổ khối lượng của chất tiêu chuẩn acid benzoic.
Sản phẩm B có thời gian lưu là 7,8 phút (HPLC), phổ khối lượng thu được bằng phân tích GCMS cho thấy một đỉnh ion phân tử m/z 164, các mảnh ion chính ở m/z 105 [M-COOCH3] (100%) và 77 [C6H5] (16,4%) tương ứng với cấu trúc của hợp chất chứa chức carboxyl, một chuỗi n-propyl và một gốc phenyl. So sánh với thời gian lưu và phổ khối lượng và phổ hấp phụ UV/Vis của sản phẩm chuẩn là 2- phenylpropionic acid.
Sản phẩm C có phổ khối lượng là 178 nặng hơn sản phẩm B 14 đơn vị carbon tương ứng với một nhóm metyl trong phân tử. So sánh dữ liệu phân tích HPLC và GCMS với các chất chuẩn có sẵn xác định được sản phẩm C là 3- phenylbutyric acid. Sản phẩm D có thời gian lưu 11,4 phút (HPLC) dài hơn so với các sản phẩm B và C. Kết quả phân tích GCMS cho thấy trọng lượng phân tử m/z 206, lớn hơn sản phẩm C 28 đơn vị carbon tương đương với 2 nhóm metyl trong phân tử, kết hợp kết quả phổ UV/Vis, thời gian lưu và phổ khối lượng cho thấy sản phẩm D có thể là 5-phenylhexanoic acid.
Sản phẩm E có phổ khối lượng m/z 176 là do 3-phenylbutyric acid bị mất 2 nguyên tử hydro. Các ion phân mảnh chính khác tại m/z 145 [C6H5
CCH3C(CH)CO] (91,2%), 117 [C6H5 CCH3C(CH)/CH] (45,1%), 115 [CH3C (CH) CH2COOCH3] (100%), 91 [C6H5 C C/C 2H] (32,9%) và 77 [C6H5] (12,9%) tương ứng với cấu trúc chứa một nhóm chức cacboxyl, một chuỗi n-butyl với một liên kết đôi và một gốc phenyl. So sánh kết quả phân tích HPLC và GCMS cho thấy cấu trúc của sản phẩm E là ß-metylcinnamic acid.
Từ các kết quả trên, đã xác định được tên của các sản phẩm trung gian A, B, C, D và E tương ứng là benzoic acid, 2-phenylpropionic acid, 3-phenylbutyric acid, 5-phenylhexanoic acid, và ß-methylcinnamic acid (Bảng 3.19). Bảng 3.19. Cấu trúc hóa học của các sản phẩm trung gian
Met tR 1 UV/Vis-spectrum (min) A 6.0 COOH 6.0 st 12.3 12.3 st download by : skknchat@gmail.com
77 B 7.8 7.8 st C 8.9 9.0 st D 9.4 9.4st E 13.8
thời gian lưu của các sản phẩm trong quá trình phân tích GCMS; st: chất chuẩn)
Ngoài 5 sản phẩm trên, kết quả phần tích HPLC và GCMS trên môi trường nuôi cấy dạng biofilm còn phát hiện một hợp chất có phổ khối lượng m/z 120, với các mảnh ion ở m/z 105 [C6H5CCCH3/CH] hoặc 105 [C6H5CCO] và 77 [C6H5], kết
78
hợp so sánh thời gian lưu trên phân tích HPLC cho thấy sản phẩm F này là acephenone.
Sản phẩm G được phát hiện với hàm lượng rất nhỏ trong dạng nuôi cấy biofilm bởi phân tích GCMS với thời gian lưu là 21,6 phút, phổ khối lượng m/z 196, các ion phân mảnh m/z 163, m/z 149, m/z 135, m/z 122 và m/z 107 phù hợp với các thông số của chất chuẩn acid 2,3-dihydroxybenzoic.
3.6.4. Con đường phân hủy sec-hexylbenzene của chủng Trichosporon asahii B1
Động học của sự chuyển hóa sec-hexylbenzene được xác định bằng phương pháp lấy mẫu phân tích sự có mặt của các chất chuyển hóa trung gian theo chu kỳ thời gian khác nhau. Các chất trung gian được phát hiện bằng việc so sánh phổ UV/Vis và thời gian lưu so với các chất tiêu chuẩn, kết quả được trình bày ở Hình 3.32.
Kết quả xác định động học các chất chuyển hóa trung gian cho thấy, trong môi trường nuôi cấy chủng nấm men B1 ở dạng tự do và ở dạng biofilm acid 5- phenylhexanoic xuất hiện với nồng độ khá cao lần lượt là 0,016 µM và 0,012 µM. Acid 3-phenylbutyric được phát hiện sau 4h nuôi cấy và tăng nhẹ sau 8h ở cả 2 điều kiện tế bào dạng tự do và biofilm. Các hợp chất 2-phenylpropionic acid, ß- methylcinnamic acid và acid benzoic chỉ xuất hiện trên trên điều kiện nuôi cấy ở dạng biofilm chủng nấm men B1 với nồng độ thấp.
Hàm lượng cơ chất sec-hexylbenzene trong cả điều kiện nuôi cấy tế bào dạng tự do và biofilm đều cho thấy sự suy giảm nồng độ theo thời gian, ở dạng biofilm sau 48h nồng độ sec-hexylbenzene giảm 34,46% và ở điều kiện tế bào tự do giảm 18,17% sau 48h.
Trong điều kiện nuôi cấy ở dạng biofilm, acid 3-phenylbutyric được ước tính giảm 25,34% sau 96h. Tiếp tục sử dụng acid 3-phenylbutyric làm cơ chất cho sự biến đổi tại canh trường biofilm phát hiện ß-methylcinnamic acid sau 4h và được duy trì nồng độ ở mức cao đáng kể đạt 0,1 µM. Tiếp tục sử dụng ß-methylcinnamic acid làm chất nền cho sự biến đổi, sau 24h phát hiện các hợp chất bao gồm acid benzoic và acid phenylacetic ở thời gian lưu trong phân tích HPLC lần lượt là 6,4 và 6,0 phút. Trong khi đó ở canh trường tế bào dạng tự do không có sản phẩm nào được phát hiện. Nghiên cứu của Sariaslani và cs [113] đã chứng minh con đường phân hủy của acid 3-phenylbutyric diễn ra bởi vi khuẩn
Pseudomonas sp. thông qua hai con đường khác nhau, bao gồm oxy hóa acid 3- phenylbutyric để tạo thành 3- (2,3-dihydroxyphenyl) butyric acid và phân cắt vòng meta, oxy hóa chuỗi ankyl để tạo thành 3-phenylpropionic thông qua các sản phẩm acid benzoic và acid phenylacetic. Do đó có thể cho rằng các sản phẩm acid benzoic và acid phenylacetic là sản phẩm trung gian của quá trình chuyển hóa acid 3- phenylbutyric.
Tiếp tục sử dụng 50ppm acid 2-phenylpropionic làm cơ chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy dạng biofilm của chủng nấm men B1 để nghiên cứu động học. Kết quả phân tích HPLC và GCMS cho thấy sự xuất hiện của 3 chất chuyển hóa trung gian bao gồm acetophenone, acid benzoic và acid 2,3-dihydroxybenzoic. Trong khi đó ở canh trường tế bào tự do chỉ phát hiện acetophenone. Dự trên sự suy giảm của acid 2-phenylbutyric trên cả 2 canh trường tế bào tự do và biofilm, cho thấy sự xuất hiện của acetophenone chính là do sự biến đổi sinh học của acid 2-phenylpropionic. Sự chuyển hóa của acid 2-phenylpropionic thành acetophenone cũng được báo cáo trên chủng nấm Trichosporon mucoides và một số chủng vi khuẩn Mycobacterium
neoaurum, Nocardiacyriacigeorgica và Rhodococcus ruber khi nuôi cấy trên môi
trường sec-octylbenzene [114]. Chất chuyển hóa này sau đó bị hydroxyl hóa để tạo thành acid benzoic.
Khi sử dụng acetophenone làm cơ chất nghiên cứu trong canh trường biofilm, acid benzoic và acid 2,3-dihydroxybenzoic được phát hiện. Sự xuất hiện của acid benzoic như là chất trung gian của quá trình phân hủy acetophenone có thể được giải thích bởi sự oxy hóa Bayer-Villiger trên acetophenone để tạo thành sản phẩm trung gian là este rồi chuyển hóa thành acid benzoic và methanol.
a)
80
b)
c) Hình 3.32. Động học các chất trung gian chuyển hóa sec-hexylbenznen bởi chủng
nấm men Trichosporon asahii B1. a)- Dạng tế bào tự do; b)- Dạng biofilm; c)- Động học các chất trung gian chuyển hóa 3-phenylbutyric acid
( 5- phenylhexanoic acid; (▲) 3-phenylbutyric acid; (□) 2-phenylpropionic acid;
( acid benzoic; ( ⃰) ß-methylcinnamic; (○) sec-hexylbenzene Dựa trên các sản phẩm tạo thành này và các nghiên cứu đã công bố, chúng tôi đã xây dựng được con đường giả định về sự chuyển hóa của hợp chất sec-
hexylbenzene bời màng sinh học của chủng nấm men Trichosporon asahii B1. Kết quả được trình bày trong Hình 3.33.
81
Hình 3.33. Dự đoán con đường phân hủy của sec-hexylbenzene bởi T. asahii B1
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ
4.1. Khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật trên vật liệu mang
Khả năng hình thành biofilm của các chủng vi sinh vật phụ thuộc rất lớn vào đặc tính của bề mặt chất rắn sử dụng làm vật liệu mang [115]. Trong các loại vật liệu mang sử dụng trong nghiên cứu bao gồm sỏi nhẹ, xơ dừa, cellulose và mút xốp đều là những loại vật liệu được sử dụng phổ biến làm vật liệu mang vi sinh vật, có các đặc tính phù hợp như bề mặt thô ráp, diện tích bề mặt lớn và phổ biến, rẻ tiền ở Việt Nam cũng như trên thế giới.
Khả năng hình thành biofilm của vi sinh vật trên vật liệu mang được đánh giá bằng mật độ vi sinh vật tồn tại trên vật liệu mang đó, trong nghiên cứu này vật liệu mang mút xốp có mật độ vi sinh đạt 1,65*1010CFU/cm3 tương đương với mật độ vi sinh được báo cáo trên vật liệu mang carbon hoạt tính dạng hạt (1-4*1010 CFU/cm3) [106]. Kết quả tạo biofilm trên vật liệu mang mút xốp trong nghiên cứu này cũng cho kết quả mật độ vi sinh đạt cao hơn so với báo cáo của Félix de Castro và cs
[103] khi sử dụng vi khuẩn Cupriavidus necator để tạo biofilm trên vật liệu mang
mút xốp, kết quả mật độ vi sinh đạt 107 CFU/cm3. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Whitehead & Verran [115], khả năng hình thành của biofilm trên vật liệu mang không chỉ chịu sự ảnh hưởng của đặc tính của vật liệu mang mà còn phụ thuộc vào các đặc tính của tế bào vi sinh vật, trên cùng một vật liệu mang
nhưng với các chủng vi sinh vật có khả năng tạo biofilm khác nhau sẽ tạo nên biofilm trên vật liệu có cấu trúc cũng như mật độ khác nhau trên vật liệu.
Các kết quả mật độ vi sinh trên vật liệu mang sỏi nhẹ, xơ dừa và cellulose đều cho kết quả đạt trên 1011 CFU/cm3, trong đó vật liệu mang xơ dừa cho kết quả cao nhất với 3,9*1012 CFU/cm3. Các kết quả khả năng hình thành biofilm trên vật liệu mang trong nghiên cứu này cũng phù hợp với báo cáo của Savage [116] về mật độ vi sinh vật trong biofilm có thể đạt tới 1012 CFU/cm3.
Một số báo cáo về biofilm trên các vật liệu mang khác cũng cho kết quả mật độ vi sinh thấp hơn so với các vật liệu mang được sử dụng trong nghiên cứu này. Félix de Castro và cs [103] cho thấy biofilm được hình thành trên vật liệu mang sử dụng vật liệu Polyester (PES) dạng không dệt có kết quả mật độ vi sinh đạt lên tới 2,3*109 CFU/cm3, trong khi đó các vật liệu kim loại và gỗ chỉ đạt 108 CFU/cm3.
Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy vi sinh vật có khả năng hình thành biofilm tốt trên các vật liệu mang như mụn xơ dừa, trấu, gốm, polypropylene,... Hỗn hợp chủng vi khuẩn Halomonas sp., Pseudomonas aeruginosa, Marinobacter
mobilis và Gaetbulibacter sp. Cho khả năng hình thành biofilm trên vật liệu mang là
mụn xơ dừa và bột trấu với mật độ vi sinh đạt 109 CFU/g [116]. Các chủng vi khuẩn phân hủy các thành phần trong nước thải của nhà máy thực phẩm đem lại hiệu quả xử lý nước thải cao và cũng có khả năng hình thành biofilm trên vật liệu gốm tốt với mật độ vi sinh đạt 2,9*109 CFU/g [118]. Chủng vi khuẩn phân hủy dầu thô trong môi trường nước mặn Pseudomonas fluorescenes có khả năng tạo biofilm với mật độ lên tới 1,48*108 CFU/g trên vật liệu hấp phụ dầu polypropylene [119].
Ngoài biện pháp cố định vi sinh vật bằng khả năng tạo biofilm của vi sinh vật trên vật liệu mang, biện pháp cố định vi sinh vật trên vật liệu mang bằng chất bám dính (support matrix) được sử dụng phổ biến nhất trong phân hủy sinh học [120]. Nghiên cứu của Zommere & Nikolajeva [121] sử dụng alginate là chất bám dính để cố định hỗn hợp chủng vi sinh vật phân hủy dầu lên đất sét đạt mật độ cao nhất ở 108 CFU/cm3. Một số nghiên cứu trước đó và hiện nay cũng chứng minh gel aginate và gar có khả năng cố định tốt các chủng vi sinh vật với mật độ lên đến 107-109 CFU/cm3 [122, 123, 124]. Sự khác biệt căn bản của hai biện pháp cố định vi sinh