3. Nội dung nghiên cứu
1.4. Một số nghiên cứu nuôi cấy dừa cạn bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro
1.4.1. Tình hình nuôi cấy in vitro dừa cạn trên thế giới
Dừa cạn là loại cây thuốc quý, chứa hợp chất alkaloid có giá trị về mặt y dược nên đã được quan tâm nghiên cứu từ lâu trên thế giới. Những năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu hướng sản xuất ra các loại alkaloid trong điều kiện nuôi cấy in vitro.
Agnieszka Pietrosiuk và CS (2007) đã nghiên cứu phương pháp nuôi cấy
Catharanthus roseus trong điền kiện in vitro, cung cấp nguồn nguyên liệu thực vật để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp từ alkaloid. Dưới sự tác động của enzyme, alkaloid monomerice, vindoline và catharanthine hình thành vinblastine trong tế bào nuôi cấy in vitro. Kết quả quan trọng của nghiên cứu này là, ajmalicine tổng hợp với lượng lớn từ mô sẹo, catharanthine thu được trong lá và tế bào nuôi cấy trong bình bioreactor. Rễ tơ được tạo ra bằng cách nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào mô sẹo. Các chất chuyển hóa thứ cấp mức thu được từ rễ tơ cao hơn so với các cây ngoài tự nhiên. Các alkaloid chiếm ưu thế trong rễ tơ là ajmalicine, serpentine, vindoline và catharanthine hàm lượng cao hơn trong rễ chưa chuyển gen [15].
Felipe Vázquez-Flota (2008), nghiên cứu ảnh hưởng cường độ và thời gian chiếu sáng tới quá trình tổng hợp vindoline của dừa cạn trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Nuôi cấy dừa cạn trong ống nghiệm, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, hàm lượng vindoline đạt tối đa, kết quả đó trùng hợp với hoạt động tối đa của deacetylvindoline acetyl CoA acetyltransferase (enzyme xúc tác bước cuối cùng trong sinh tổng hợp vindoline). Như vậy, khả năng tổng hợp vindoline phụ thuộc vào hoạt động của của deacetylvindoline acetyl CoA acetyltransferase (DAT) trong thời gian chiếu sang tối ưu 16 giờ/ngày [16].
Taha và CS (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các amino acid đến sự tổng hợp ankaloid của dừa cạn trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Ở Ai Cập, vinblastine và vincristine là 2 alkaloid được quan tâm để sản xuất thuốc chống ung thư. Nuôi cấy dừa cạn trên môi trường MS có bổ sung kinetin 1,0mg/l, trong điều kiện ánh sang 16 giờ/ngày. Bổ sung các amino acid: L-tryptophane, L-glutamine, L-asparagine, L-cystine, L-arginine với các nồng độ 100mg/l; 300mg/l; 500mg/l. Sau đó theo dõi sự tăng trưởng tế bào và đánh giá khả năng tổng hợp alkaloid trong tế bào, so sánh với đối chứng. Kết quả cho thấy, tế bào sinh trưởng tốt nhất, hàm lượng vinblastine và vincristine đạt cao nhất trong môi trường MS bổ sung: L-glutamin 300mg/l, L-tryptophane 300mg/l. Kết quả bổ sung từng loại amino acid theo thứ tự: L-glutamine; L-asparagin; L-cystine; L-tryptophane; L-arginine nồng độ 300 mg/l, số lượng tế bào tối đa/bình tương ứng giảm dần: 5,2 .105; 4,82.105; 4,75.105; 3,77.105; 3,65.105. Trọng lượng tươi (g/bình) tương ứng đạt 2,93; 2,74; 2,65; 2,43 2,35. Trọng lượng khô (g/bình) tương ứng đạt 0,21; 0,19; 0,17; 0,16; và 0,14. Đối với hàm lượng alkaloid cây tự nhiên là 1,002%, khi bổ sung lần lượt từng loại amino acid: L-tryptophane; L-glutamine; L-asparagine; L-cystine và L-arginine ở nồng độ 300mg/l, tỉ lệ phần trăm alkaloid tổng số cao hơn trong trong cây tự nhiên rất nhiều, đạt 1,57; 1,45; 1,32; 1,17 và 1,03% [22].
Mohsen Zargar và CS (2010) đã nghiên cứu tạo rễ tơ của cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium Rhizogenes trong điều kiện in vitro, để sản xuất và thu sinh khối 2 loại alkaloid vinbalastine và vincristine. Tiến hành nuôi cấy các đoạn thân 15 ngày tuổi có chiều dài 0,7 - 1,0cm trên môi trường MS và bổ sung BA (31,1mM) và NAA (5,4mM). Nuôi cấy 8 tuần trong điều kiện tối ở nhiệt độ 20 - 250C. Kết quả tạo mô sẹo sau 8 tuần đạt 90%. Nhiễm khuẩn mô sẹo trong thời gian 30 phút, đồng nuôi cấy trong thời gian 48 giờ. Rửa khuẩn bằng dung dịch ½MS bổ sung cefataxime 800mg/l. Cấy mô nhiễm khuẩn trên môi trường ½MS, cefataxime 400mg/l,
không bổ sung chất kích thích sinh trưởng, nuôi cấy điều kiện tối, sau 10 ngày rễ tơ hình thành. Sau 8 tuần rễ tơ dài 8 - 9 cm. Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Mohsen Zargar và CS đã tách được vinblastine và vincristine từ rễ tơ thu được [20].
Nhóm tác giả Mohammed F. và CS (2011), đã nghiên cứu quy trình tái sinh dừa cạn từ đoạn thân mang mắt chồi bên trong ống nghiệm. Mục đích của nghiên cứu này nhằm nhân nhanh số lượng cây giống dừa cạn để phục vụ sản xuất vinbastine và vincristine. Nhóm tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất kích thích thuộc nhóm cytokinin và auxin đến quá trình nuôi cấy. Kết quả cho thấy, nồng độ BAP 0,5mg/l + NAA 1,0mg/l thích hợp nhất cho sự phát sinh chồi. Phản ứng ra rễ tốt trên môi trường ½MS bổ sung IBA 0,1mg/l. Ra cây trên giá thể đất cho tỉ lệ sống đạt 100% [19].
Nghiên cứu của Kumar A và CS (2013) cho thấy, hiệu quả phát sinh chồi tốt nhất trên môi trường MS bổ sung BAP 1,0mg/l, NAA 0,2mg/l. Ra rễ trên môi trường ½MS bổ sung IBA 1,0 mg/l cho số lượng rễ đạt 4,2 rễ/chồi, chiều dài rễ đạt 1,72cm. Sau đó, đánh giá tính ổn định di truyền của một số tính trạng nghiên cứu của cây dừa cạn trong nuôi cấy in vitro bằng kĩ thuật RAPD. Kumar A (2013) đã cho thấy, không có biến dị soma trong nuôi cấy in vitro ở dừa cạn [17].
Như vậy, các công trình nghiên cứu đều tập chung vào để sản xuất 2 loại alkaloid là vinbastine và vincristine trong điều kiện nuôi cấy in vitro, tạo nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc chữa ung thư. Đã có những nghiên cứu về môi trường cho hệ thống tái sinh, tuy nhiên với mỗi công trình nghiên cứu có một kết quả riêng phù hợp với từng điều kiện nuôi cấy. Vì vậy, với mục đích tăng hàm lượng alkaloid của dừa cạn sản xuất đại trà trong tự nhiên, đối với điều kiện cụ thể ở ở Việt Nam cần thiết thăm dò một môi trường tối ưu cho hệ thống tái sinh dừa cạn để phục vụ chuyển gen hiệu quả.
1.4.2. Tình hình nuôi cấy in vitro cây dừa cạn ở Việt Nam
Hiện nay, ở Việt Nam các công trình nghiên cứu nuôi cấy cây dừa cạn trong điều kiện in vitro tập trung theo các hướng: Nuôi cấy huyền phù để sản xuất sinh khối; Nuôi cấy rễ tơ thu các hợp chất alkaloid; Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố như phytohormon thuộc nhóm auxin, cytokinin đến quá trình tổng hợp alkaloid phục vụ mục đích nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp từ dừa cạn.
Ở Việt Nam, nghiên cứu về cây dừa cạn bắt đầu được công bố vào năm 2006 với công trình của Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng. Nghiên cứu của các tác giả thực hiện trên mô sẹo xanh cảm ứng từ lá dừa cạn nuôi cấy in vitro
trong môi trường MS lỏng, bổ sung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin, đường sucrose với nồng độ khác nhau, nuôi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày. Sau đó đặt vào máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 250C. Kết quả cho thấy, bổ sung NAA 1,0mg/l + kinetin 0,5mg/l cho sinh khối trọng lượng khô đạt trọng lượng khô 6,88g/l và hàm lượng alkaloid toàn phần 89,26mg/l. Trong khi đó, bổ sung 2,4-D 1,0mg/l + kinetin 0,5mg/1 sinh khối trọng lượng khô chỉ đạt 4,8g/l và alkaloid toàn phần 45,5mg/l. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose đến nuôi cấy huyền phù tế bào cho thấy, đường sucrose 60g/l cho kết quả nuôi cấy tốt nhất đạt: Sinh khối trọng lượng khô 7,54g/l, alkaloid toàn phần 110,55mg/l. Kết hợp tổ hợp NAA 1,0mg/l + kinetin 0,5mg/1+ sucrose 60g/l đã thu được hàm lượng vincristine từ mô nuôi cấy cao hơn lá dừa cạn ngoài tự nhiên [7].
Mục đích khảo sát hàm lượng alkaloid vinblastine trong cây dừa cạn tự nhiên và trong nguồn mô thực vật nuôi cấy in vitro, làm cơ sở cho những nghiên cứu sản xuất chất này trong điều kiện in vitro. Nguyễn Văn Vinh (2010) đã nghiên cứu điều kiện của quá trình tái sinh chồi, rễ, và tạo dịch huyền phù tế bào, khảo sát định tính vinblastine ở cây dừa cạn, các loại mô nuôi cấy in vitro. Cảm ứng tạo mô sẹo từ các tế bào nhu mô libe gân chính của tử diệp dừa cạn,
đạt hiệu quả cao trên môi trường MS bổ sung 2,4-D 1,0mg/l, BA 0,5mg/l. Phát sinh chồi từ mô sẹo kết quả tốt nhất trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5mg/l và BA 2,0mg/l. Rễ phát sinh từ mô sẹo tốt nhất trên môi trường MS bổ sung NAA 1,0mg/l. Dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ mô sẹo trên môi trường MS bổ sung 2,4-D 0,5mg/l và BA 0,5mg/l. Căn cứ vào lượng kết tủa và phản ứng màu đặc trưng của thuốc thử đối với các loại alkaloid, đánh giá định tính thì các mẫu tự nhiên và mẫu nuôi cấy in vitro đều chứa alkaloid vinblastine. Mẫu mô sẹo và dịch huyền phù có hàm lượng alkaloid vinblastine thấp hơn mẫu tự nhiên, chồi và rễ nuôi cấy in vitro [13].
Tuy nhiên, hướng chuyển gen tăng khả năng tổng hợp alkaloid vinblastine, vincristine trên thế giới còn khá mới mẻ nên các công trình nghiên cứu môi trường tối ưu để phục vụ công tác chuyển gen còn hạn chế. Đây cũng là hướng trọng tâm mà đề tài này sẽ nghiên cứu.
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hoá chất
2.1.1. Vật liệu thực vật
Hạt giống dừa cạn (hoa màu tím) mua tại Công ty giống cây trồng Tam Đảo.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị
Hoá chất
Các thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường cơ bản MS [1].
Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và thông dụng có nguồn gốc từ Đức, Trung Quốc như các chất kích thích sinh trưởng BAP, kinetin, NAA, đường sucrose, thạch, than hoạt tính, ethanol, NaOH…
Thiết bị
Bình tam giác 250ml, pipet, cốc thủy tinh định mức, đũa thủy tinh. Bông, giấy làm nút, giấy thấm. Bộ đồ cấy: dao cấy, que cấy, đĩa cấy. Buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie (Mĩ). Nồi khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy (Nhật). Tủ sấy (Carbolite, Anh), máy đo pH, cân kĩ thuật, cân phân tích, bếp điện....
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 1 năm 2014 đến tháng 10 năm 2014 tại phòng Công nghệ tế bào, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Pha môi trường
Pha môi trường với thành phần và nồng độ các chất phù hợp. Môi trường có đầy đủ các muối khoáng vitamin…, các chất phải được tan đều, không kết tủa. Môi trường bổ sung thạch làm giá đỡ không quá rắn hay quá mềm để khi cấy mẫu vật dễ dàng.
Sau khi xác định được công thức môi trường cần pha, tính thể tích các hóa chất cần sử dụng trong môi trường nuôi cấy.
Sau đó, môi trường được khử trùng trong nồi khử trùng ở 1200 C, áp suất 1 -1,2 atm, trong thời gian 20 phút. Trong quá trình lấy môi trường ra khỏi nồi khủ trùng, lắc nhẹ bình chứa môi trường nuôi cấy để than hoạt tính tan đều. Môi trường sau khi hấp để 2 -3 ngày bắt đầu sử dụng.
2.2.2. Khử trùng hạt
Hạt dừa cạn rửa sạch dưới vòi nước, loại bỏ hạt lép. Sau đó, xát cho mỏng vỏ hạt, rửa hạt bằng nước sạch nhiều lần, để ráo nước.
Hạt được đưa vào trong box cấy để khử trùng, bằng cách lắc trong ethanol 700 khoảng thời gian 1phút. Sau đó, tráng hạt 5 lần bằng nước cất khử trùng. Tiếp tục lắc hạt trong dung dịch javen 60%, lắc đều trong khoảng thời gian 5, 10,15, 20 phút. Tiếp theo, rửa sạch hạt 10 - 15 lần bằng nước cất khử trùng.
Sau khi khử trùng, cấy hạt lên môi trường MS có bổ sung sucrose 30g/l, agar 8,5g/l, pH = 5,8. Các công thức thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Đánh giá kết quả sau 10 ngày nuôi cấy. Theo dõi các chỉ số sau:
(1) Tổng số hạt nảy mầm. (2) Số hạt không bị nhiễm.
(3) Số hạt nảy mầm không bị nhiễm/tổng số hạt.
2.2.3. Nghiên cứu môi trường phát sinh chồi và sinh trưởng
Sau khi vào mẫu thành công, thu được các cây con nảy mầm từ hạt. Lá mầm của hạt sau khi nảy mầm và các đoạn thân mang mắt chồi bên của các cây con nói trên được sử dụng làm vật liệu cấy trên môi trường tạo chồi. Để tìm ra môi trường tạo chồi và môi trường tạo rễ trong ống nghiệm tối ưu, chúng tôi đã bố trí các thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy.
Các đoạn thân mang mắt tạo chồi bên, nách lá mầm được cấy lên môi trường tạo chồi BAP với nồng độ từ 0,5mg/l; 1,0mg/l; 1,5mg/l; 2,0mg/l và môi
trường bổ sung kinetin với nồng độ tương tự như BAP. Từ hai chất kích thích sinh trưởng trên chọn ra chất cảm ứng tốt với quá trình tạo chồi.
Sau đó, lặp lại thí nghiệm, cấy các đoạn thân mang mắt chồi bên, nách lá mầm vào môi trường bổ sung tổ hợp của cytokine với nhóm auxin. Chọn chất kích thích sinh trưởng cảm ứng tốt với quá trình tạo chồi tổ hợp chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (NAA, IBA). Mỗi công thức nuôi cấy trên 30 mô, lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá sau 4, 6, 8, 10 tuần nuôi cấy tùy theo tốc độ sinh trưởng của chồi. Theo dõi các chỉ số sau:
(1) Số chồi/mẫu.
(2) Chiều cao của chồi.
(3) Chất lượng chồi: Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá xanh; Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi gầy, lá xanh; Chồi sinh trưởng kém: Chồi gầy, lá xanh nhạt hoặc xoăn, chồi bị dị dạng.
2.2.4. Phương pháp gây tổn thương tạo chồi
Sau khi tìm được môi trường tối ưu cho công thức tạo chồi tiếp tục gây tổn thương đoạn thân bánh tẻ chứa mắt chồi bên, giai đoạn 8 - 10 tuần tuổi bằng phương pháp:
(1) Chẻ dọc qua mấu thân mang mắt chồi bên nhưng không làm đứt mô hoàn toàn.
(2) Dùng mũi dao châm vào mấu thân mang mắt chồi bên.
Sau đó, ngâm mẫu đã được gây tổn thương vào dung dịch MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng tối ưu của môi trường tạo chồi (không có khuẩn) khoảng 20 phút. Tiếp tục nuôi cấy mẫu trên môi trường đặc, trong điều kiện tối 2 ngày. Sau 2 ngày, cấy mẫu lên môi trường phát sinh chồi tối ưu. Theo dõi sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi.
2.2.5. Nghiên cứu môi trường tạo rễ
Những chồi tạo ra có từ 4 - 5 lá, được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ bổ sung chất kích thích sinh trưởng NAA, IBA với nồng độ 0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,3mg/l; 0,5mg/l; 1,0mg/l vào môi trường MS và ½ MS. Mỗi công thức thí
nghiệm được tiến hành trên 30 chồi, lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá sau 8 tuần nuôi cấy. Theo dõi các chỉ số sau:
(1) Tỉ lệ chồi ra rễ. (2) Số rễ/chồi.
(3) Chất lượng rễ; Rễ tốt: Bề mặt rễ trơn nhẵn, dài; Rễ trung bình: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu trắng; Rễ kém: Bề mặt rễ sùi, rễ xốp, màu trắng.
2.2.6. Nghiên cứu giá thểđưa cây ra tự nhiên
Chọn cây dừa cạn sau 8 tuần nuôi cấy có bộ rễ dài, khỏe, lá xanh, đang thời kì sung sức để đưa ra môi trường tự nhiên. Tiêu chuẩn cây con: kích thước trung bình cây khoảng 5cm. Rễ dài khoảng 3 - 4cm. Số lá đạt 8- 10 lá.
Phương pháp ra cây, trước khi đưa cây con ra trồng ngoài tự nhiên tiến hành huấn luyện để cây quen dần với điều kiện môi trường bên ngoài bằng cách: Đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên, không cho ánh sáng chiếu trực tiếp vào bình nuôi cây. Thời gian này kéo dài khoảng 7 ngày, tăng dần cường độ chiếu sáng vào những ngày cuối để tăng nhanh khả năng thích nghi của cây. Sau đó, các bình cây được mở nắp, đổ nước vào ngâm 15 phút, lắc nhẹ để thạch rời ra khỏi rễ, dùng panh gắp nhẹ các cây ra khỏi bình không để dập nát. Rửa sạch phần thạch và đường bám vào vì chúng thường là môi trường thích hợp cho nấm bệnh phát triển hoặc côn trùng tấn công. Sau đó, ngâm cây trong chậu nước sạch để tránh hiện tượng mất nước rồi đem trồng