2. Mục tiêu của đề tài
3.3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế Nitric Oxide (NOs Iinhibtion) từ
dịch chiết nƣớc mẫu lá của loài F. hirta Vahl
3.3.1.1.Chuẩn bị mẫu thử và cách xác định giá trị IC50
Chúng tôi tiến hành xác định khả năng ức chế NO chiết nước từ mẫu lá của loài F. hirta Vahl., xác định hàm lượng Nitrite được xem là chỉ thị cho việc tạo NO.
Chuẩn bị mẫu thử nghiệm
-Lipopolysaccharides (LPS) từ Escherichia-coli của Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) were from Life Technologies, Inc., (Gaithersburg, MD, USA). Sodium nitrite, sulfanilamide, N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride and dimethyl sulphoxide (DMSO) của Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen, Promega v.v.
-Dòng tế bào RAW 264.7 do GS. TS. Domenico Delfino, Đại học Perugia, Italia cung cấp.
Chuẩn bị mẫu đối chứng
Đối chứng dương: NG-Methyl-L-arginine acetate (L - NMMA) (Sigma) ở các nồng độ 100 µg/ml, 20 µg/ml, 4 µg/ml, 0.8 µg/ml.
Công thức tính khả năng ức chế sản sinh NO
Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức: % ức chế = 100%- [hàm lượng NOsample/hàm lượng NOLPS] x 100
Cách tính giá trị IC50
Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính Table Curve 2Dv4.
3.3.1.2. Khả năng ức chế NO của dịch chiết nước mẫu lá của loài F. hirta Vahl
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và dữ liệu thu được. Dưới đây là kết quả xác định IC50của dịch chiết nghiên cứu.
Hình 3.15: Đƣờng chuẩn NaNO2
Bảng 3.6: Khả năng ức chế sản sinh NO của các mẫu nghiên cứu Nồng độ (µg/ml) L-NMMA VB % ức chế NO % tế bào sống % ức chế NO % tế bào sống 100 91.59 81.44 50.19 99.47 20 71.35 90.05 23.50 102.84 4 29.11 17.83 0.8 15.97 -2.97 IC50 8.68±0.73 - 94.41±7.37 - y = 0.0115x + 0.0488 R² = 0.9996 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 10 20 30 40 50 60 Series1 Linear (Series1)
Nhận xét: Qua số liệu xác định khả năng ức chế NO của dịch nước mẫu
lá (khô) của loài F. hirta Vahl. kết quả thể hiện trên bảng 3.5 cho thấy:
Dịch chiết nước mẫu lá của loài F. hirta Vahl. có khả năng ức chế tế bào đại thực bào sản sinh NO qua phép thử MTT với 94.41±7.37 so với chất đối
chứng là L - NMMA có IC50 = 8.68±0.73 thì khả năng ức chế NO của dịch chiết nước mẫu lá (khô) của loài F. hirta Vahl. bằng 10.8% so với chất chu n L - NMMA. Chất đối chứng tham khảo L - NMMA hoạt động ổn định trong thí nghiệm.
So với dịch nước mẫu lá (tươi) của loài F. hirta Vahl có có thể hiện khả năng ức chế tế bào đại thực bào sinh NO ở mức trung bình với IC50 =
62.51±5.21µg/ml. so với chất đối chứng là L - NMMA có IC50 = 7.64±0.47 thì
khả năng ức chế NO của dịch chiết nước mẫu lá (tươi) của loài F. hirta Vahl. bằng 8.18 % so với chất chu n L - NMMA.
Vậy khả năng ức chế NO của dịch nước mẫu lá (khô) của loài F. hirta
Vahl. tốt hơn so với mẫu lá (tươi).
3.3.2. Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh của dịch chiết nƣớc mẫu lá (khô) của loài F. hirta Vahl
3.3.2.1. Chuẩn bị mẫu thử và cách xác định giá trị IC50
Chuẩn bị mẫu thử nghiệm
Mẫu thử được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành dãy 4 nống độ theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất là 128 µg/ml. Lấy mẫu thử đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng thêm dung dịch vi khu n và nấm có nồng độ 5×105CFU/ml, ủ ở 370C/24h.
Công thức tính phần trăm ức chế vi sinh vật khi có mặt chất thử:
IC (%) = 100 x
ODtest – ODcontrol(+) ODcontrol(-) – ODcontrol(+)
Cách tính giá trị IC50
Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
3.3.2.2. Khả năng ức chế vi sinh vật của dịch chiết nước mẫu lá của loài F. hirta Vahl
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa phương pháp dãy nồng độ trên môi trường lỏng. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khu n mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (minimum inhibitor concentration- nồng độ tối thiểu ức chế), IC50 (50% inhibitor concentration - nồng độ ức chế 50%), MBC (minimum bactericidal concentration - nồng độ tối thiểu diệt khu n).
Bảng 3.7: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh vật kiển định
TT Tên mẫu
Giá trị IC50 đối với các chủng (g/ml)
Gram (+) Gram (-) Nấm Staphylo coccus aureus Bacillus subtilis Lactobacillus fermentum Salmonella enterica Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Candida albican 1 Ficus >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256
Nh n t: Mẫu lá (khô) của loài F. hirta Vahl. không thể hiện hoạt tính ức chế vi sinh vật kiểm định ở nồng độ nhỏ hơn hoặc bằng 256 µg/ml.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. Kết luận
1. Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Ficus tại huyện Bắc Sơn- Tỉnh Lạng Sơn. Kết quả cho thấy trên địa bàn huyện Bắc Sơn- Tỉnh Lạng Sơn phân bố chủ yếu 04 loài của chi Ficus là Ficus racemosa L, Ficus hispida L.f, Ficus benghalensis, Ficus hirta Vahl. Trong đó phổ biến nhất là Ficus racemosa L và Ficus hirta Vahl.
2. Từ phần lá (khô) của Ficus hirta Vahl. đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học được 02 chất trong cặn ethyl acetate:
- 3β-acetoxyurs-12-en-11-one
- 7H-furo[3,2-g]chromen-7-one (Psoralene)
Cả hai hợp chất này đều có vai trò là các dẫn chất trong tổng hợp hữu cơ và là dược chất được sử dụng trong y học.
3. Kết quả xác định về hoạt tính sinh học từ dịch chết nước mẫu từ lá (khô) của loài F. hirta Vahl. đã xác định được:
Về hoạt tính ức chế Nitric oxide (N Osinhibition):
Dịch chiết nước mẫu từ lá của loài F. hirta. Vahl. có thể hiện khả năng ức chế tế bào đại thực bào sinh NO ở mức trung bình có giá trị IC50 là 94.41±7.37 µg/ml (bằng 10,8 % so với chất chu n L - NMMA).
Về hoạt tính kháng vi sinh:
Dịch chết nước mẫu từ lá của loài F. hirta. Vahl. không thể hiện hoạt tính ức chế vi sinh vật kiểm định ở nồng độ nhỏ hơn hoặc bằng 256 µg/ml.
Kết quả nghiên cứu trên đã định hướng cho việc sử dụng loài F. hirta.
Vahl. trong y dược và trong dân gian, do hoạt tính dược lý, hoạt tính chống oxy hóa, cũng như một số hoạt tính sinh học khác của chúng.
II. Kiến nghị
Trên các kết quả nghiên cứu trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi nhận thấy loài F. hirta Vahl ở Bắc Sơn- Lạng Sơn có hoạt tính sinh học nhất là trong việc điều trị giảm đau và tác dụng chống oxy hóa. Bởi vậy cần có các nghiên cứu tiếp theo trong Y - dược về khả năng dùng F. hirta Vahl. làm vị thuốc thiên nhiên, hữu ích trong y học.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
1. Nguyễn Tiến Bân, Trần Thị Phương Anh, Lê Kim Biên, Nguyễn Quốc Bình, Hà Thị Dụng, Nguyễn Văn Dư, Trần Đình Đại, Nguyễn Kim Đào, Nguyễn Thị Đỏ, Nguyễn Hữu Hiến, Nguyễn Tiến Hiệp, Vũ Văn Hợp, Dương Đức Huyến, Trần Công Khánh, Nguyễn Đăng Khôi, Nguyễn Khắc Khôi, Trần Kim Liên, Phan Kế Lộc, Trần Đình Lý, Trần Ngọc Ninh, Vũ Xuân Phương, Hà Minh Tâm, Nguyễn Nghĩa Thìn, Đỗ Thị Xuyến, Arnautov NN, Averyanov LV, Budantsev AL, Dorofeev VI, Mikhailova M, Serov VP, Skvortsova NT. Danh lục các loài thực v t Việt Nam. Tập II, Nhà xuất bản Nông nghiệp, 2003, tr. 180-203.
2. Võ Văn Chi (2019). Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà uất bản Y học.
3. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam. Nhà uất bản Trẻ, TPHCM.
4. Cầm Thị Ính, Trần Hồng Quang, Châu Văn Minh, Hoàng Thanh Hương, Phan Văn Kiệm (2009). “Phân lập và xác định cấu trúc hai dẫn xuất C13 norisoprenoid từ lá cây đề - Ficus religiosa L. (Moraceae)”. Tạp chí Dược học, 395: 40-43.
5. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr 49.
6. Lã Đình Mỡi, Trần Minh Hợi, Dương Đức Huyến, Trần Huy Thái, Ninh Khắc Bản (2005). Tài nguyên thực v t Việt Nam - Những cây chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học, NXB Nông nghiệp, T. I, tr. 127-129.
Tiếng Anh
7. Anat Solomon, Sara golubowicz, Zeev Yablowicz, Shlomo Grossman, Margalit Bergman, Hugo E. Gottieb, Arie Altman, Zohar Kerem Anf Moshe A. Flaishman. Antioxidant Activities and Anthocyanin Content of Fresh Fruits of Common Fig (Ficus carica L.). J. Agric. Food Chem, 2006, Vol. 54, No. 20.
8. Akhir NAM, Chua LS, Majid FAA, Sarmidi MR. Cytotoxicity of aqueous and ethanolic extracts of Ficus deltoidea on human ovarian carcinoma cell line. British Journal of Medicine and Medical Research, 2011;1(4): 397–409.
9. Bliebtrau, J.N. The Parable of the Beast, New York: Macmillan Company, via Singh and Goel, 2009, p. 74.
10.Jun Cheng, Xiaomin Yi, Yihai Wang, Xingjun Huang, Xiangjiu He.
Phenolics from the roots of hairy fig (Ficus hirta Vahl.) exert prominent anti-inflammatory activity. Journal of Functional Foods, 2017, 31, p.79–88. 11.Kita Jima J, M. Arai, and Y. Tanaka. Triterpenoid constituents of Ficus
thunbergii. Chem. Pharm. Bull, (Tokyo), 1994, 42: 608–10.
12.Kuether, V.B. Ngameni, C.C. Simo et al. Antimicrobial activity of the crude extracts and compounds from Ficus chlamydocarpa and Ficus cordata (Moraceae). J Ethnopharmacol, 2008, 120: 17–24.
13.M.H.A. Elgamal, N.H. Elewa, E.A.M Elkhrisy and Hemut Duddeck (1979).
13
C NMR Chemical shifts and carbon-proton coupling constans of some furocoumarins and furocoumones. Vol. 18, pp.139-143.
14.Meng, Z., Y. Wang, J. Ji, and W. Zhong. Studies of chemical constituents of Ficus carica L. Zhongguo Yaoke Daxue Xuebao, 1996, 27: 202–204.
15.Mpiana, P.T, V. Mudogo, D.S. Tshibangu et al. Antisickling activity of anthocyanins from Bombax pentadrum, Ficus capensis and Ziziphus mucronata:
Photodegradation effect. J Ethnopharmacol, 2008, 120: 413–418.
16.Nobuko Sakurai, Yoshikatsu Yaguchi and Takao Inoue (1987).
Triterpenoids from Myrica rubra. Phytochemistry 26(1), 217-219.
17.Orlacchio, A, C. Maffei, C. Emiliani, and J.A. Reinosa. On the active site of β-hexosaminidase from latex of Ficus glabrata. Phytochemistry, 1985, 24: 659–62.
18.Shen J. H, Nakamura, Y. Fujisaki et al. Effect of 4G-alpha-glucopyranosyl hesperidin on brown fat adipose tissue- and cutaneous-sympathetic nerve activity and peripheral body temperature. Neurosci Lett, 2009, 461: 30–5.
19.Singh AB, Yadav DK, Maurya R, Srivastava AK. Antihyperglycaemic activity of α-amyrin acetate in rats and db/db mice. Nat. Prod. Res, 2009, 23(9): 876-882.
20.Yui Akihara, Emi Ohta, Tatsuo Nehira, Hisashi Omura and Shinji Ohta.
New prenylated ortho-dihydroxycoumarins from the fruits of Ficus nipponica .Chemistry & Biodiversity, 2017, Volume 14, Issue 9, e1700196. 21.Bekatorou, A., A. Sarellas, N.G. Ternan et al. Low-temperature brewing using
yeast immobilized on dried fgs. J Agric Food Chem, 2002, 50: 7249–57.
22.Amakura Y, T. Tsutsumi, K. Sasaki, M. Nakamura, T. Yoshida and T. Maitani. Influence of food polyphenols on aryl hydrocarbon receptor- signaling pathway estimated by in vitro bioassay. Phytochemistry, 2008, 69: 3117–3130.
23.Augusti K.T, P.S.P. Anuradha, K.B. Smitha, M. Sudheesh, A. George and M.C. Joseph. Nutraceutical effects of garlic oil, its nonpolar fraction and a Ficus flavonoid as compared to vitamin E in CCl4 induced liver damage in rats. Indian J. Exp. Biol, 2005, 43:437–44.
24.Chang-KeunSung, Seung-MiKim, Chang-JinOh, Sun-A.Yang, Byung- HeeHan, Eun-KyoungMo. Taraxerone enhances alcohol oxidation via
increases of alcohol dehyderogenase (ADH) and acetaldehyde
dehydrogenase (ALDH) activities and gene expressions. Food and Chemical Toxicology Volume 50, (2012), 2508-2514.
25.Chunpeng Wan, Chuying Chen, Mingxi Li, Youxin Yang, Ming Chen and Jinyin Chen. Chemical Constituents and Antifungal Activity of F. hirta Vahl. Fruits. Plants, 2017, 6, p.44.
26.Deeb D, X. Gao, H. Jiang, S.A. Dulchavsky and S.C. Gautam. Oleanane triterpenoid CDDO-Me inhibits growth and induces apoptosis in prostate cancer cells by independently targeting pro-survival Akt and mTOR. Prostate, 2009, 69: 851–60.
27.Dr. Duke (2018). Duke's Phytochemical and Ethnobotanical Databases. U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service.
28.Jun Cheng, Xiaomin Yi, Yihai Wang, Xingjun Huang, Xiangjiu He.
Phenolics from the roots of hairy fig (Ficus hirta Vahl.) exert prominent anti-inflammatory activity. Journal of Functional Foods, 2017, 31, p.79–88. 29.Jung Wha Kim, Tae Bum Kim, Hyun Woo Kim, Sang Wook Park, Hong
Pyo Kim and Sang Hyun Sung. Hepatoprotective Flavonoids in Opuntia F. indica Fruits by Reducing Oxidative Stress in Primary Rat Hepatocytes. Pharmacogn Magazine, 2017, 13(51), 472–476.
30.Kuether V, F. Nana, B. Ngameni, A.T. Mbaveng, F. Keumedjio and B.T. gadjui. Antimicrobial activity of the crude extract, fractions and compounds from stem bark of Ficus ovata (Moraceae). J. Ethnopharmacol, 2009, 124: 556–61.
31.Lansky, E.P., H.M. Paavilainen, A.D. Pawlus, and R.A. Newman. Ficus spp. (fg): Ethnobotany and potential as anticancer and anti-inflammatory agents. J. Ethnopharmacol, 2008, 119: 195–213.
32.Li R.W, S.P. Myers, D.N. Leach, G.D. Lin, and G. Leach. A cross-ultural study: antiinflammatory activity of Australian and Chinese plants. J. Ethnopharmacol, 2003, 85: 25–32.
33.Nettelblad H, Vahlqvist C, Krysander L, Sjöberg F (1996). Psoralens used for cosmetic sun tanning: an unusual cause of extensive burn injury. Burns. 22 (8): 633–5. doi:10.1016/S0305-4179(96)00028-9. PMID 8982544.
34.Rao, R.B., K. Anuparna, K.R. Swaroop, T. Murugesan, M. Pal, and S.C.
Mandal. Evaluation of anti-pyretic potential of Ficus racemosa bark.
Phytomedicine, 2002, 9: 731–3.
35.Saffran WA, Ahmed A, Binyaminov O, Gonzalez C, Gupta A, Fajardo MA, Kishun D, Nandram A, Reyes K, Scalercio K, Senior CW (2014). "Induction of direct repeat recombination by psoralen-DNA adducts in
Saccharomyces cerevisiae: defects in DNA repair increase gene copy number variation". Vol 21: pp. 8796. doi: 10.1016/j.dnarep. 2014.05.011. PMID 24969513
36.Shenoi, Shrutakirthi D.; Prabhu, Smitha; Indian Association of Dermatologists, Venereologists and Leprologists (November 2014).
Photochemotherapy (PUVA) in psoriasis and vitiligo. Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 80 (6): 497–504. doi:10.4103/0378-6323.144143. ISSN 0973-3922. PMID 25382505.
37.Shunyo Matsunaga, Reiko Tanaka and Masao Akagi (1988). Triterpennoids from euphorbia maculate. Phytochemistry, Vol.27, No 2, pp.535-537.
38.Singh AB, Yadav DK, Maurya R, Srivastava AK. Antihyperglycaemic activity of α-amyrin acetate in rats and db/db mice. Nat. Prod. Res, 2009, 23(9): 876-882.
39.Singh D, and R.K. Goel. Anticonvulsant effect of Ficus religiosa: Role of serotonergic pathways. J. Ethnopharmacol, 2009, 123: 330–4.
40.Takahiro Masuda, Mitsuo Takasugit and Masaki Aneta (1998). Psoralen and other linear furanocoumarins as phytoalexins in glehnia littoralis.
Phytochemistry, Vol. 47, No. 1, pp. 13-16.
41.Tuyen NV, Kim DSHL, Fong HS, Soejarto DD, Khanh TC, Tri MV, Xuan LT Structure elucidation of two triterpenoids from Ficus fistulosa. Phytochemistry, 1998, 50: 467-469.
42.Wu Q, Christensen LA, Legerski RJ, Vasquez KM (June 2005). "Mismatch repair participates in error-free processing of DNA interstrand crosslinks in human cells". EMBO Rep. 6 (6): 551–7. doi:10.1038/sj.embor.7400418. PMC 1369090. PMID 15891767.
43.Yanliang Wang, Hong Liang, Qingying Zhang, Wei Cheng, Sirong Yi.
Phytochemical and chemotaxonomic study on F. tsiangii Merr. ex Corner. Biochemical Systematics and Ecology, 2014, 57, 210e215.
44.Yanliang Wang, Hong Liang, Qingying Zhang, Wei Cheng, Sirong Yi.
Phytochemical and chemotaxonomic study on F. tsiangii Merr. ex Corner. Biochemical Systematics and Ecology, 2014, 57, 210e215.
45.Yui Akihara, Emi Ohta, Tatsuo Nehira, Hisashi Omura and Shinji Ohta.
New prenylated ortho-dihydroxycoumarins from the fruits of Ficus nipponica .Chemistry & Biodiversity, 2017, Volume 14, Issue 9, e1700196. 46.Yui Akihara, Emi Ohta, Tatsuo Nehira, Hisashi Omura and Shinji Ohta.
New prenylated ortho-dihydroxycoumarins from the fruits of Ficus nipponica .Chemistry & Biodiversity, 2017, Volume 14, Issue 9, e1700196.