Xác định cấu trúc các chất

2. Mục tiêu của đề tài

2.3.3. Xác định cấu trúc các chất

Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1

H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC).

2.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính sinh học

2.4.1. Phƣơng pháp xác định hoạt tính ức chế Nitric oxide (NOs inhibition)

Hoạt tính ức chế nitric oxide (NOs inhibition) của mẫu nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7 sau đó làm phép thử sinh học xác định khả năng gây độc tế bào bằng MTT.

2.4.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng sinh

Được thực hiện dựa trên phương pháp dãy nồng độ trên môi trường lỏng. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khu n mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (minimum inhibitor concentration-nồng độ tối thiểu ức chế), IC50 (50% inhibitor concentration-nồng độ ức chế 50%), MBC (minimum bactericidal concentration- nồng độ tối thiểu diệt khu n).

2.5. Thực nghiệm

2.5.1. Quá trình phân lập các chất từ mẫu lá Vú Bò (khô)

2.5.1.1. Quy trình tạo cặn chiết ethyl acetate từ mẫu lá Vú Bò (khô)

Quy trình tạo cặn chiết ethyl acetate từ lá (khô) của loài F. hirta Vahl. được trình bày theo hình 2.1.

Quy trình chiết mẫu phần lá của loài F. hirta Vahl. (4.5 kg) được nêu trong hình 2.1. -Mẫu lá của loài F. hirta Vahl. được rửa sạch, băm nhỏ (4.5 kg) và hong khô tránh ánh nắng mặt trời; thu được 1,15 kg mẫu lá khô. Ngâm mẫu lá khô trong Etanol 900, vớt bã lá, vắt kiệt bã lá, thu được dịch Etanol . Gộp 2 lần dịch chiết, đưa lên bếp cách thủy đun ở 700C cho tới khi thu được cao đặc (85.7 gam).

-Cao thu được cho vào phễu chiết, ngâm trong ethyl acetate trong 7 ngày, 2 ngày thay 1 lần dung môi, kết hợp lắc đều.

-Sau đó lọc và gộp các dịch chiết của từng lần với nhau, quay cất dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết ethyl acetate (11.2 gam).

2.5.1.2. Phân lập các chất từ cặn chiết ethyl acetate

Quá trình phân lập các chất từ cặn chiết ethyl acetate mẫu lá khô của loài

F. hirta Vahl. được trình bày theo hình 2.1.

Lấy 8 gam cặn chiết ethyl acetate được hòa tan vừa đủ bằng hỗn hợp dung môi EtOAc /MeOHvà trộn với 60 g silicagel, quay cất đến khô, sau đó nghiền thành bột mịn để các chất hấp phụ đều trên silicagel. Bột silicagel có t m dịch chiết này được sử dụng để đưa lên cột sắc ký.

Silicagel Merck (cỡ hạt 0,043-0,063 mm; 200 g) được nhồi vào cột sắc ký theo phương pháp nhồi ướt với dung môi ban đầu là EtOAc 100%. Sau khi cột đã ổn định, bột silicagel t m dịch chiết được đưa lên cột và giải hấp với hệ dung môi rửa giải là CHCl3: EtOAc: MeOH có độ phân cực tăng dần thu được các phân đoạn khác nhau. Từ các phân đoạn này được gộp thành các phân đoạn có kí hiệu là: VBE7 và VBE15, theo kết quả kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng.

Phân đoạn VBE7 được làm sạch lại trên cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là CHCl3: EtOAc: MeOH=15:80:5→0:70:30 thu được 13,6 mg chất sạch thứ nhất ký hiệu là VB1. Sắc kí lại trên cột silicagel chất rắn xuất hiện ở phân

đoạn VBE15 được kết tinh lại trong hỗn hợp CH2Cl2/ MeOH thu được 16,5 mg chất sạch thứ hai ký hiệu là VB2.

Quy trình chiết tách và phân lập hai chất trên được thể hiện trên hình 2.1.

Hình 2.1: Sơ đồ chiết, tách các chất từ mẫu lá khô của loài F. hirta Vahl

SKC silicagel: CH2Cl2: EtOAc: MeOH=10:85:5→0:70:30

1. Rửa sạch, băm nhỏ; phơi khô

2. Chiết trong Etanol 900*2 lần; cách thủy ở 700C

3. Đun bếp cách thủy bay hơi nước ở 700 C thu được cao chiết

SKC silicagel= CHCl3: EtOAc: MeOH, tăng từ 10:85:5→0:70:30

1. Phân lớp ethyl acetate trong 2. Quay cất dung môi dưới áp suất giảm

Mẫu lá (tƣơi) loài F. hirta Vahl (4,5 kg)

Cặn (45.19g)

Cao EtOAc (VBE2) Cao EtOH (VBE1)

(85,7g) Phân đoạn VBE7 Chất VB1 (13,6mg) Chất VB2 (16,5mg) Phân đoạn VBE 15 SKC silicagel: CH2Cl2: EtOAc: MeOH=10:85:5→0:80:20

2.5.2. Dữ kiện phổ của các chất phân lập đƣợc

2.5.2.1. Chất VB1: 3β-acetoxyurs-12-en-11-one

- Là chất bột màu trắng, khối lượng 13,6 mg - HR-ESI-MS m /z:  1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH 5.54 (1H, s, H-12), 4.52 (1H, dd, J = 12.0, 4.5 Hz, H-3), 2.75 (1H, bd, J = 13.5 Hz, H-1a), 2.35 (1H, s, H-9), 2.05 (3H, s, CH3CO-), 1.29 (3H, s, H-27), 1.19 (3H, s, H-25), 1.17 (3H, s, H-26), 0.95 (3H, br s, H-30), 0.89 (3H, s, H-23), 0.88 (3H, s, H-24), 0.82 (3H, s, H- 28), 0.80 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-29).  13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC 199.62 (C=O), 170.93 (COCH3), 164.90 (C-13), 130.40 (C-12), 80.64 (C-3), 61.44 (C-9), 59.00 (C-18), 55.01 (C-5), 45.11 (C-8), 43.63 (C-14), 40.92 (C-22), 39.29 (C-20), 39.21 (C-19), 38.89 (C-1), 38.02 (C-4), 36.82 (C-10), 33.92 (C-17), 32.81 (C-7), 30.89 (C- 21), 28.82 (C-28), 28.06 (C-23), 27.50 (C-15), 27.23 (C-16), 23.58 (C-2), 21.28 (C-30), 21.13 (CH3CO-), 20.49 (C-27), 18.52 (C-26), 17.46 (C-29), 17.45 (C- 6), 16.71 (C-25), 16.54 (C-24). 2.5.2.2. VB2: Psoralene

- Là chất bột, màu trắng, khối lượng 16,5 mg

 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3):δH 7.80 (1H, d, J = 9.5 Hz, H-4), 7.69 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 7.68 (1H, s, H-5), 7.48 (1H, s, H-8), 6.84-6.83 (1H, m, H- 3′), 6.38 (1H, d, J = 9.5 Hz, H-3).  13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC 161.01 (C-2), 156.44 (C-7), 152.06 (C- 9), 146.91 (C-2′), 144.05 (C-4), 124.89 (C-6), 119.84 (C-5), 115.44 (C-10), 114.67 (C-3), 106.38 (C-3′), 99.98 (C-8).

2.5.3. Xác định khả năng ức chế Nitric oxide

2.5.3.1. Xác định nuôi cấy tế bào in vitro

- Dòng tế bào RAW264.7 được nuôi cấy trong môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES và 1.0 mM sodium pyruyate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum - FBS (GIBCO).

- Tế bào được cấy chuyển sau 3 - 5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 370C, 5% CO2.

2.5.3.2. Xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7

- Tế bàoRAW 274.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2×105 tb/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 370

C và 5% CO2 trong 24h.

- Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ, thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3h.

- Tế bào sau đó được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1 µg/ml) trong 24h.

- Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng trong dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng âm. Trong khi đối chứng dương được sử dụng là

NG-Methyl-L-arginine acetate (L - NMMA) (sigma) ở các nồng độ 100; 20; 4 và 0.8 m µg/ml.

- Nitrie (NO2-), được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Cụ thể là, 100 µl môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thêm vào 100 µL Griess reagent: 50 µl of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) phosohoric acid và 50 µl 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nước.

- Hỗn hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo bằng máy microplate reader ở bước sóng 540 nm. Môi trường DMEM không FBS được sử dụng như giếng trắng (blanks).

- Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chu n NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS).

- Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức: % ức chế = 100% - [hàm lượng NOsample/hàm lượng NOLPS] x 100

- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính Table Curve 2Dv4.

2.5.3.3. Phép thử sinh học xác định khả năng gây độc tế bào bằng MTT

- Chất thử (20 µl) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ tương tự nồng độ của thí nghiệm NO.

- Sau khi điều chỉnh để có mật độ tế bào phù hợp, hút (180 µl) tế bào vào các giếng của khay 96 giếng đã có chất thử. Trên cùng một đĩa thử, bố trí một số giếng để làm đối chứng không có mẫu thử, chỉ có dung môi pha mẫu là DMSO 10%.

- Để đĩa nuôi cấy vào trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 370C, 5% CO2, nuôi trong thời gian 72 giờ.

- Sau 72 giờ, 10 µl MTT (nồng độ cuối cùng là 5 mg/ml) được cho vào mỗi giếng. - Sau 4h, loại bỏ môi trường, tinh thể formazan được hòa tan bằng 50 µl (DMSO) 100%.

- Giá trị OD đo ở bước song 540 nm bằng máy quang phổ. - Lượng tế bào sống sót sẽ được tính theo công thức:

2.5.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh

Pha loãng mẫu thử: Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy 4 nồng độ theo yêu cầu và mục đính thử. Nồng độ thử cao nhất là 128 µl/ml.

Thử hoạt tính: Lấy 20 µl dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200 µl dung dịch vi khu n và nấm có nồng độ 5×105 CFU/ml, ủ ở 370C/24h.

Xử lý kết quả:

- Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của sinh vật.

- Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.

% tế bào sống sót =

OD (chất thử) – OD (đối chứng trắng) OD (DMSO) – OD (đối chứng trắng)

- Giá trị MBC được xác định bằng số khu n lạc trên đĩa thạch.

Chất tham khảo:

- Kháng sinh Ampicillin cho các chủng vi khu n Gram ( ) với các giá trị MIC trong khoảng 0.004 - 1.2 µg/ml.

- Kháng sinh Cefotaxim cho các chủng vi khu n Gram (-) với giá trị MIC trong khoảng 0.07 - 19.23 µg/ml.

- Kháng nấm Nystatin cho chủng nấm với giá trị MIC trong khoảng 2.8 - 5.0 µg/ml.

2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý trên hệ thống Excel và GraphPad Prism. IC (%) = 100 x

ODtest – ODcontrol(+) ODcontrol(-) – ODcontrol(+)

Chƣơng 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập các chất từ cặn chiết ethyl acetate mẫu lá khô của loài F. hirta Vahl.

Mẫu lá tươi của loài F. hirta Vahl. rửa sạch; phơi khô và ngâm chiết thu được 85.7 gam cặn ethyl acetate (sơ đồ 2.1).

Lấy 8 gam cặn chiết ethyl acetate được hòa tan vừa đủ bằng hỗn hợp dung môi EtOAc /MeOHvà trộn với 60 g silicagel, quay cất đến khô, sau đó nghiền thành bột mịn để các chất hấp phụ đều trên silicagel. Bột silicagel có t m dịch chiết này được sử dụng để đưa lên cột sắc ký.

Từ 8,0 g cặn ethyl acetate mẫu lá của loài F. hirta Vahl. được phân tách bằng sắc ký cột silicagel với các hệ dung môi khác nhau thu được 2 chất sạch: ký hiệu là VB1, VB2.

+ Chất VB1: 13,6 mg hiệu suất 1.18 ×10-3 % so với trọng lượng mẫu lá. + Chất VB2: 16.5 mg hiệu suất 1.43 ×10-3 % so với trọng lượng mẫu lá.

3.2. Xác định cấu trúc chất tách đƣợc

Cấu trúc hóa học của 2 chất sạch VB1, VB2 được xác định dựa vào dữ

liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, DEPT và so sánh với tài liệu tham khảo.

3.2.1. Chất VB1: 3β-acetoxyurs-12-en-11-one

Kết hợp với số liệu phổ khối phân giải cao 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC (Bảng 3.1, 3.2) chúng tôi đã xác định được công thức cấu tạo của chất VB1

như sau:

3.2.1.1. Phân tích phổ 1H-NMR (CDCl3 δH ppm)

Chất VB1 phân lập được dưới dạng chất rắn, màu trắng. Phổ 1H-NMR của chất VB1 cho tín hiệu đặc trưng của một triterpene khung ursan-12-ene với tám nhóm methyl, trong đó sáu nhóm methyl bậc ba [δH 1.29 (3H, s, H-27), 1.19 (3H, s, H-25), 1.17 (3H, s, H-26), 0.89 (3H, s, H-23), 0.88 (3H, s, H-24), 0.82 (3H, s, H-28)] và hai methyl bậc hai [δH 0.95 (3H, br s, H-30), 0.80 (3H, d,

J = 6.5 Hz, H-29)] cùng với một proton của nối đôi [δH 5.54 (1H, s, H-12)]. Ngoài ra nó còn cho tín hiệu của một nhóm acetyl ở δH 2.04 (3H, s, CH3CO).

Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của chất VB1

Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): chất VB1 Vị trí Chất VB1 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) δH 1a 2.75 (1H, bd, J = 13.5 Hz) 3 4.52 (1H, dd, J = 12.0, 4.5 Hz) 9 2.35 (1H, s) 12 5.54 (1H, s) 23 0.89 (3H, s) 24 0.88 (3H, s) 25 1.19 (3H, s) 26 1.17 (3H, s) 27 1.29 (3H, s) 28 0.82 (3H, s) 29 0.80 (3H, d, J = 6.5 Hz) 30 0.95 (3H, br s) CH3CO- 2.05 (3H, s,)

3.2.1.2. Phân tích phổ 13C-NMR và HSQC (CDCl3, δC ppm) của chất VB1

Hình 3.4: Phổ 13C-NMR của chất VB1

Hình 3.7: Phổ HMBC của chất VB1

Phổ 13C-NMR và HSQC của chất VB1 cho tín hiệu của 32 nguyên tử

carbon gồm một nhóm ketone carbonyl (δC 199.62), một nhóm acetyl [δC 170.93 (CH3CO-), 21.12 (-COCH3)], tám carbon methylene, bảy nhóm methine, tám nhóm methyl và sáu carbon bậc bốn. Vị trí của nhóm acetoxy được xác định ở vị trí C-3 dựa vào tương tác HMBC giữa proton H-3 (δH 4.52) với carbons C-23 (δC

với ketone carbon (δC 199.62), C-8 (δC 45.11), C-10 (δC 36.82); giữa H-12 (δH

5.54) với carbon C-9 (δC 61.44), C-14 (δC 43.63) và C-18 (δC 59.00) trên phổ HMBC đã xác định vị trí của nhóm ketone là ở vị trí C-11. Bảng 3.2: Số liệu phổ 13C-NMR chất VB1 Vị trí Chất VB1 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC 1 38.89 2 23.58 3 80.64 4 38.02 5 55.01 6 17.45 7 32.81 8 45.11 9 61.44 10 36.82 12 130.40 13 164.90 14 43.63 15 27.50 16 27.23 17 33.92 18 59.00 19 39.21 20 39.29 21 30.89 22 40.92 23 28.06 24 16.54 25 16.71 26 18.52 27 20.49 28 28.82 29 17.46 30 21.28 C=O 199.62 -COCH3 170.93 CH3CO- 21.13

Từ việc phân tích dữ liệu phổ NMR một chiều và hai chiều và so sánh với tài liệu tham khảo [16,37], chất VB1 được xác định là 3β-acetoxyurs-12-en- 11-one.

Chúng tôi lập luận được công thức cấu tạo của 3β-acetoxyurs-12-en-11-one. được mô tả như (Hình 3.8)

Hình 3.8: Công thức cấu tạo của chất VB1

3.2.2. Chất VB2: Psoralene

Kết hợp số liệu phổ khối phân giải cao 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, (Bảng 3.3; 3.4; 3.5) chúng tôi đã xác định được công thức cấu tạo của chất VB2 như sau:

3.2.2.1. Phân tích phổ 1H-NMR (CDCl3 δH ppm)

Hình 3.10: Phổ 1H-NMR của chất VB2 Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H-NMR của chất VB2 Vị trí Chất VB2 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) δH 2′ 7.69 (1H, d, J = 2.0 Hz) 3 6.38 (1H, d, J = 9.5 Hz) 3′ 6.84-6.83 (1H, m) 4 7.80 (1H, d, J = 9.5 Hz) 5 7.68 (1H, s) 8 7.48 (1H, s)

Phổ 1H-NMR của VB2 ở vùng trường thấp cho các tín hiệu của một cặp doublet của vòng α-pyrone ở δH 7.80 (1H; d; J = 10,0 Hz, H-4) và 6.38 (1H, d,

J = 9.5 Hz, H-3) và hai singlet của hai proton thơm ở δH 7.68 (1H, s, H-5) và 7.48 (1H, s, H-8). Ngoài ra, trên phổ này còn cho tín hiệu của hai proton nhân furan [δH 7.69 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′) và 6.84-6.83 (1H, m, H-3′)]. Từ dữ liệu phân tích trên và kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [13], chúng tôi dự đoán chất VB2 là một furanocoumarin.

3.2.2.2. Phân tích phổ 13C-NMR và DEPT (CDCl3, δC ppm)

Hình 3.11: Phổ 13C-NMR của chất VB2

Hình 3.13: Phổ HSQC của chất VB2 Bảng 3.4: Số liệu phổ 13C-NMR của chất VB2 Vị trí Chất VB2 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC 2 161.01 2′ 146.91 3 114.67 3′ 106.38 4 144.05 5 119.84 6 124.89 7 156.44 8 99.98 9 152.06

Phù hợp với phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR và HSQC cho tín hiệu của 11 nguyên tử carbon, trong đó có 01 nhóm carbonyl; 5 nhóm methine và 05 carbon bậc bốn. So sánh số liệu phổ 13C-NMR của chất VB2 và hợp chất tham khảo [40], số liệu theo bảng sau:

Bảng 3.5: So sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của chất VB2 và hợp chất tham khảo [40] Vị trí Phổ 1 H-NMR của chất và Psoralene (500 MHz; CDCl3 Phổ 13 C-NMR của chất VB2 và Psoralene (125 MHz; CDCl3

δH của VB2 δH của Psoralene δC của VB2 δC của

Psoralene 2 - - 161.01 161.0 2’ 7.69 (1H, d, J = 2.0 Hz) 7.70 (1H, d,J = 2.0 Hz) 146.91 146.9 3 6.38 (1H, d, J = 9.5 Hz) 6.38 (1H, d, J = 9.8 Hz) 114.67 114.6 3’ 6.84-6.83 (1H, m) 6.83 (1H, dd, J = 2.0, 1.0 Hz) 106.38 106.4 4 7.80 (1H, d, J = 9.5 Hz) 7.80 (1H, d,J = 9.8 Hz) 144.05 144.1 5 7.68 (1H, s) 7.68 (1H, s) 119.84 119.9 6 - - 124.89 124.9 7 - - 156.44 156.4 8 7.48 (1H, s) 7.46 (1H, br s) 99.98 99.8 9 - - 152.06 152.0 10 - - 115.44 115.4

Dựa vào các tín hiệu phổ đã được phân tích ở trên và so sánh số liệu phổ

1

H-NMR, 13C-NMR của chất VB2 với số liệu của hợp chất Psoralene [40] là trung khớp do đó hợp chất VB2 được xác định là Psoralene. Công thức cấu tạo của Psoralene được mô tả như (Hình 3.14)

Hình 3.14: Công thức cấu tạo chất VB2: 7H-furo[3,2-g]chromen-7-one (Psoralene)

Psoralene là hợp chất gốc trong một họ các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên được gọi là furanocoumarins mạch không nhánh. Nó có cấu trúc liên quan đến coumarin bằng cách bổ sung một vòng furan hợp nhất, và có thể