2. Mục tiêu của đề tài
2.5.3. Xác định khả năng ức chế Nitric oxide
2.5.3.1. Xác định nuôi cấy tế bào in vitro
- Dòng tế bào RAW264.7 được nuôi cấy trong môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES và 1.0 mM sodium pyruyate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum - FBS (GIBCO).
- Tế bào được cấy chuyển sau 3 - 5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 370C, 5% CO2.
2.5.3.2. Xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7
- Tế bàoRAW 274.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2×105 tb/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 370
C và 5% CO2 trong 24h.
- Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ, thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3h.
- Tế bào sau đó được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1 µg/ml) trong 24h.
- Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng trong dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng âm. Trong khi đối chứng dương được sử dụng là
NG-Methyl-L-arginine acetate (L - NMMA) (sigma) ở các nồng độ 100; 20; 4 và 0.8 m µg/ml.
- Nitrie (NO2-), được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Cụ thể là, 100 µl môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thêm vào 100 µL Griess reagent: 50 µl of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) phosohoric acid và 50 µl 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nước.
- Hỗn hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo bằng máy microplate reader ở bước sóng 540 nm. Môi trường DMEM không FBS được sử dụng như giếng trắng (blanks).
- Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chu n NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS).
- Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức: % ức chế = 100% - [hàm lượng NOsample/hàm lượng NOLPS] x 100
- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính Table Curve 2Dv4.
2.5.3.3. Phép thử sinh học xác định khả năng gây độc tế bào bằng MTT
- Chất thử (20 µl) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ tương tự nồng độ của thí nghiệm NO.
- Sau khi điều chỉnh để có mật độ tế bào phù hợp, hút (180 µl) tế bào vào các giếng của khay 96 giếng đã có chất thử. Trên cùng một đĩa thử, bố trí một số giếng để làm đối chứng không có mẫu thử, chỉ có dung môi pha mẫu là DMSO 10%.
- Để đĩa nuôi cấy vào trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 370C, 5% CO2, nuôi trong thời gian 72 giờ.
- Sau 72 giờ, 10 µl MTT (nồng độ cuối cùng là 5 mg/ml) được cho vào mỗi giếng. - Sau 4h, loại bỏ môi trường, tinh thể formazan được hòa tan bằng 50 µl (DMSO) 100%.
- Giá trị OD đo ở bước song 540 nm bằng máy quang phổ. - Lượng tế bào sống sót sẽ được tính theo công thức:
2.5.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh
Pha loãng mẫu thử: Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy 4 nồng độ theo yêu cầu và mục đính thử. Nồng độ thử cao nhất là 128 µl/ml.
Thử hoạt tính: Lấy 20 µl dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200 µl dung dịch vi khu n và nấm có nồng độ 5×105 CFU/ml, ủ ở 370C/24h.
Xử lý kết quả:
- Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của sinh vật.
- Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
% tế bào sống sót =
OD (chất thử) – OD (đối chứng trắng) OD (DMSO) – OD (đối chứng trắng)
- Giá trị MBC được xác định bằng số khu n lạc trên đĩa thạch.
Chất tham khảo:
- Kháng sinh Ampicillin cho các chủng vi khu n Gram ( ) với các giá trị MIC trong khoảng 0.004 - 1.2 µg/ml.
- Kháng sinh Cefotaxim cho các chủng vi khu n Gram (-) với giá trị MIC trong khoảng 0.07 - 19.23 µg/ml.
- Kháng nấm Nystatin cho chủng nấm với giá trị MIC trong khoảng 2.8 - 5.0 µg/ml.
2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý trên hệ thống Excel và GraphPad Prism. IC (%) = 100 x
ODtest – ODcontrol(+) ODcontrol(-) – ODcontrol(+)
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập các chất từ cặn chiết ethyl acetate mẫu lá khô của loài F. hirta Vahl.
Mẫu lá tươi của loài F. hirta Vahl. rửa sạch; phơi khô và ngâm chiết thu được 85.7 gam cặn ethyl acetate (sơ đồ 2.1).
Lấy 8 gam cặn chiết ethyl acetate được hòa tan vừa đủ bằng hỗn hợp dung môi EtOAc /MeOHvà trộn với 60 g silicagel, quay cất đến khô, sau đó nghiền thành bột mịn để các chất hấp phụ đều trên silicagel. Bột silicagel có t m dịch chiết này được sử dụng để đưa lên cột sắc ký.
Từ 8,0 g cặn ethyl acetate mẫu lá của loài F. hirta Vahl. được phân tách bằng sắc ký cột silicagel với các hệ dung môi khác nhau thu được 2 chất sạch: ký hiệu là VB1, VB2.
+ Chất VB1: 13,6 mg hiệu suất 1.18 ×10-3 % so với trọng lượng mẫu lá. + Chất VB2: 16.5 mg hiệu suất 1.43 ×10-3 % so với trọng lượng mẫu lá.
3.2. Xác định cấu trúc chất tách đƣợc
Cấu trúc hóa học của 2 chất sạch VB1, VB2 được xác định dựa vào dữ
liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, DEPT và so sánh với tài liệu tham khảo.
3.2.1. Chất VB1: 3β-acetoxyurs-12-en-11-one
Kết hợp với số liệu phổ khối phân giải cao 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC (Bảng 3.1, 3.2) chúng tôi đã xác định được công thức cấu tạo của chất VB1
như sau:
3.2.1.1. Phân tích phổ 1H-NMR (CDCl3 δH ppm)
Chất VB1 phân lập được dưới dạng chất rắn, màu trắng. Phổ 1H-NMR của chất VB1 cho tín hiệu đặc trưng của một triterpene khung ursan-12-ene với tám nhóm methyl, trong đó sáu nhóm methyl bậc ba [δH 1.29 (3H, s, H-27), 1.19 (3H, s, H-25), 1.17 (3H, s, H-26), 0.89 (3H, s, H-23), 0.88 (3H, s, H-24), 0.82 (3H, s, H-28)] và hai methyl bậc hai [δH 0.95 (3H, br s, H-30), 0.80 (3H, d,
J = 6.5 Hz, H-29)] cùng với một proton của nối đôi [δH 5.54 (1H, s, H-12)]. Ngoài ra nó còn cho tín hiệu của một nhóm acetyl ở δH 2.04 (3H, s, CH3CO).
Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của chất VB1
Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): chất VB1 Vị trí Chất VB1 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) δH 1a 2.75 (1H, bd, J = 13.5 Hz) 3 4.52 (1H, dd, J = 12.0, 4.5 Hz) 9 2.35 (1H, s) 12 5.54 (1H, s) 23 0.89 (3H, s) 24 0.88 (3H, s) 25 1.19 (3H, s) 26 1.17 (3H, s) 27 1.29 (3H, s) 28 0.82 (3H, s) 29 0.80 (3H, d, J = 6.5 Hz) 30 0.95 (3H, br s) CH3CO- 2.05 (3H, s,)
3.2.1.2. Phân tích phổ 13C-NMR và HSQC (CDCl3, δC ppm) của chất VB1
Hình 3.4: Phổ 13C-NMR của chất VB1
Hình 3.7: Phổ HMBC của chất VB1
Phổ 13C-NMR và HSQC của chất VB1 cho tín hiệu của 32 nguyên tử
carbon gồm một nhóm ketone carbonyl (δC 199.62), một nhóm acetyl [δC 170.93 (CH3CO-), 21.12 (-COCH3)], tám carbon methylene, bảy nhóm methine, tám nhóm methyl và sáu carbon bậc bốn. Vị trí của nhóm acetoxy được xác định ở vị trí C-3 dựa vào tương tác HMBC giữa proton H-3 (δH 4.52) với carbons C-23 (δC
với ketone carbon (δC 199.62), C-8 (δC 45.11), C-10 (δC 36.82); giữa H-12 (δH
5.54) với carbon C-9 (δC 61.44), C-14 (δC 43.63) và C-18 (δC 59.00) trên phổ HMBC đã xác định vị trí của nhóm ketone là ở vị trí C-11. Bảng 3.2: Số liệu phổ 13C-NMR chất VB1 Vị trí Chất VB1 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC 1 38.89 2 23.58 3 80.64 4 38.02 5 55.01 6 17.45 7 32.81 8 45.11 9 61.44 10 36.82 12 130.40 13 164.90 14 43.63 15 27.50 16 27.23 17 33.92 18 59.00 19 39.21 20 39.29 21 30.89 22 40.92 23 28.06 24 16.54 25 16.71 26 18.52 27 20.49 28 28.82 29 17.46 30 21.28 C=O 199.62 -COCH3 170.93 CH3CO- 21.13
Từ việc phân tích dữ liệu phổ NMR một chiều và hai chiều và so sánh với tài liệu tham khảo [16,37], chất VB1 được xác định là 3β-acetoxyurs-12-en- 11-one.
Chúng tôi lập luận được công thức cấu tạo của 3β-acetoxyurs-12-en-11-one. được mô tả như (Hình 3.8)
Hình 3.8: Công thức cấu tạo của chất VB1
3.2.2. Chất VB2: Psoralene
Kết hợp số liệu phổ khối phân giải cao 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, (Bảng 3.3; 3.4; 3.5) chúng tôi đã xác định được công thức cấu tạo của chất VB2 như sau:
3.2.2.1. Phân tích phổ 1H-NMR (CDCl3 δH ppm)
Hình 3.10: Phổ 1H-NMR của chất VB2 Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H-NMR của chất VB2 Vị trí Chất VB2 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) δH 2′ 7.69 (1H, d, J = 2.0 Hz) 3 6.38 (1H, d, J = 9.5 Hz) 3′ 6.84-6.83 (1H, m) 4 7.80 (1H, d, J = 9.5 Hz) 5 7.68 (1H, s) 8 7.48 (1H, s)
Phổ 1H-NMR của VB2 ở vùng trường thấp cho các tín hiệu của một cặp doublet của vòng α-pyrone ở δH 7.80 (1H; d; J = 10,0 Hz, H-4) và 6.38 (1H, d,
J = 9.5 Hz, H-3) và hai singlet của hai proton thơm ở δH 7.68 (1H, s, H-5) và 7.48 (1H, s, H-8). Ngoài ra, trên phổ này còn cho tín hiệu của hai proton nhân furan [δH 7.69 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′) và 6.84-6.83 (1H, m, H-3′)]. Từ dữ liệu phân tích trên và kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [13], chúng tôi dự đoán chất VB2 là một furanocoumarin.
3.2.2.2. Phân tích phổ 13C-NMR và DEPT (CDCl3, δC ppm)
Hình 3.11: Phổ 13C-NMR của chất VB2
Hình 3.13: Phổ HSQC của chất VB2 Bảng 3.4: Số liệu phổ 13C-NMR của chất VB2 Vị trí Chất VB2 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC 2 161.01 2′ 146.91 3 114.67 3′ 106.38 4 144.05 5 119.84 6 124.89 7 156.44 8 99.98 9 152.06
Phù hợp với phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR và HSQC cho tín hiệu của 11 nguyên tử carbon, trong đó có 01 nhóm carbonyl; 5 nhóm methine và 05 carbon bậc bốn. So sánh số liệu phổ 13C-NMR của chất VB2 và hợp chất tham khảo [40], số liệu theo bảng sau:
Bảng 3.5: So sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của chất VB2 và hợp chất tham khảo [40] Vị trí Phổ 1 H-NMR của chất và Psoralene (500 MHz; CDCl3 Phổ 13 C-NMR của chất VB2 và Psoralene (125 MHz; CDCl3
δH của VB2 δH của Psoralene δC của VB2 δC của
Psoralene 2 - - 161.01 161.0 2’ 7.69 (1H, d, J = 2.0 Hz) 7.70 (1H, d,J = 2.0 Hz) 146.91 146.9 3 6.38 (1H, d, J = 9.5 Hz) 6.38 (1H, d, J = 9.8 Hz) 114.67 114.6 3’ 6.84-6.83 (1H, m) 6.83 (1H, dd, J = 2.0, 1.0 Hz) 106.38 106.4 4 7.80 (1H, d, J = 9.5 Hz) 7.80 (1H, d,J = 9.8 Hz) 144.05 144.1 5 7.68 (1H, s) 7.68 (1H, s) 119.84 119.9 6 - - 124.89 124.9 7 - - 156.44 156.4 8 7.48 (1H, s) 7.46 (1H, br s) 99.98 99.8 9 - - 152.06 152.0 10 - - 115.44 115.4
Dựa vào các tín hiệu phổ đã được phân tích ở trên và so sánh số liệu phổ
1
H-NMR, 13C-NMR của chất VB2 với số liệu của hợp chất Psoralene [40] là trung khớp do đó hợp chất VB2 được xác định là Psoralene. Công thức cấu tạo của Psoralene được mô tả như (Hình 3.14)
Hình 3.14: Công thức cấu tạo chất VB2: 7H-furo[3,2-g]chromen-7-one (Psoralene)
Psoralene là hợp chất gốc trong một họ các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên được gọi là furanocoumarins mạch không nhánh. Nó có cấu trúc liên quan đến coumarin bằng cách bổ sung một vòng furan hợp nhất, và có thể được coi là một dẫn xuất của umbelliferone. Psoralen xuất hiện tự nhiên trong hạt của Psoralea corylifolia, cũng như trong quả sung, cần tây, mùi tây, gỗ sa tanh Tây Ấn Độ và trong tất cả các loại trái cây họ cam quýt. Nó được sử dụng rộng rãi trong điều trị PUVA (psoralen + UVA) cho bệnh v y nến, chàm, bạch biến và ung thư tế bào T ở da; những ứng dụng này thường thông qua việc sử dụng các loại thuốc như Methoxsalen [35].
Psoralen là một chất gây đột biến, và được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử. Psoralen xen vào DNA và khi tiếp xúc với bức xạ tia cực tím (UVA) có thể hình thành các đơn sản ph m và liên kết chéo giữa các liên kết cộng hóa trị (ICL) với các thymine, ưu tiên là tại các vị trí 5'-TpA trong bộ gen, gây ra quá trình apoptosis. Liệu pháp Psoralen tác động với tia UVA (PUVA) có thể được sử dụng để điều trị các rối loạn da tăng sinh như bệnh v y nến và một số loại ung thư da. [35, 36, 42]
Trong tự nhiên; nguồn psoralens dồi dào nhất là ở Ficus carica (cây vả). Chúng cũng được tìm thấy với số lượng nhỏ trong Ammi visnaga (bisnaga),
vulgare (hạt thì là), Daucus carota (cà rốt), Apium Tombolens (cần tây), dầu cam bergamot (bergapten). [27; 33]
3.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học từ dịch chiết nƣớc mẫu lá của loài
F. hirta Vahl
Do loài F. hirta Vahl. được coi là một vị thuốc dùng trong y dược, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế Nitro Oxide (NOs Iinhibtion), kháng vi sinh vật kiểm định mẫu lá (khô) của loài F. hirta Vahl. thu hái được ở huyện Bắc Sơn – Lạng Sơn.
3.3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế Nitric Oxide (NOs Iinhibtion) từ dịch chiết nƣớc mẫu lá của loài F. hirta Vahl dịch chiết nƣớc mẫu lá của loài F. hirta Vahl
3.3.1.1.Chuẩn bị mẫu thử và cách xác định giá trị IC50
Chúng tôi tiến hành xác định khả năng ức chế NO chiết nước từ mẫu lá của loài F. hirta Vahl., xác định hàm lượng Nitrite được xem là chỉ thị cho việc tạo NO.
Chuẩn bị mẫu thử nghiệm
-Lipopolysaccharides (LPS) từ Escherichia-coli của Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) were from Life Technologies, Inc., (Gaithersburg, MD, USA). Sodium nitrite, sulfanilamide, N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride and dimethyl sulphoxide (DMSO) của Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen, Promega v.v.
-Dòng tế bào RAW 264.7 do GS. TS. Domenico Delfino, Đại học Perugia, Italia cung cấp.
Chuẩn bị mẫu đối chứng
Đối chứng dương: NG-Methyl-L-arginine acetate (L - NMMA) (Sigma) ở các nồng độ 100 µg/ml, 20 µg/ml, 4 µg/ml, 0.8 µg/ml.
Công thức tính khả năng ức chế sản sinh NO
Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức: % ức chế = 100%- [hàm lượng NOsample/hàm lượng NOLPS] x 100
Cách tính giá trị IC50
Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính Table Curve 2Dv4.
3.3.1.2. Khả năng ức chế NO của dịch chiết nước mẫu lá của loài F. hirta Vahl
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và dữ liệu thu được. Dưới đây là kết quả xác định IC50của dịch chiết nghiên cứu.
Hình 3.15: Đƣờng chuẩn NaNO2
Bảng 3.6: Khả năng ức chế sản sinh NO của các mẫu nghiên cứu Nồng độ (µg/ml) L-NMMA VB % ức chế NO % tế bào sống % ức chế NO % tế bào sống 100 91.59 81.44 50.19 99.47 20 71.35 90.05 23.50 102.84 4 29.11 17.83 0.8 15.97 -2.97 IC50 8.68±0.73 - 94.41±7.37 - y = 0.0115x + 0.0488 R² = 0.9996 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 10 20 30 40 50 60 Series1 Linear (Series1)
Nhận xét: Qua số liệu xác định khả năng ức chế NO của dịch nước mẫu
lá (khô) của loài F. hirta Vahl. kết quả thể hiện trên bảng 3.5 cho thấy:
Dịch chiết nước mẫu lá của loài F. hirta Vahl. có khả năng ức chế tế bào đại thực bào sản sinh NO qua phép thử MTT với 94.41±7.37 so với chất đối
chứng là L - NMMA có IC50 = 8.68±0.73 thì khả năng ức chế NO của dịch chiết nước mẫu lá (khô) của loài F. hirta Vahl. bằng 10.8% so với chất chu n L - NMMA. Chất đối chứng tham khảo L - NMMA hoạt động ổn định trong thí nghiệm.
So với dịch nước mẫu lá (tươi) của loài F. hirta Vahl có có thể hiện khả năng ức chế tế bào đại thực bào sinh NO ở mức trung bình với IC50 =
62.51±5.21µg/ml. so với chất đối chứng là L - NMMA có IC50 = 7.64±0.47 thì
khả năng ức chế NO của dịch chiết nước mẫu lá (tươi) của loài F. hirta Vahl. bằng 8.18 % so với chất chu n L - NMMA.
Vậy khả năng ức chế NO của dịch nước mẫu lá (khô) của loài F. hirta
Vahl. tốt hơn so với mẫu lá (tươi).