PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Phương pháp nghiên cứu
Tất cả môi trường dùng trong các thí nghiệm được cung cấp bởi Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam.
Phương pháp thu nhận và đánh giá chất lượng tế bào trứng
Buồng trứng lợn lai kinh tế Landrace được thu tại lò mổ trong địa bàn Hà Nội. Buồng trứng được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong 1-2 giờ trong dung dịch nước muối sinh lý bổ sung kháng sinh Gentamycin với hàm lượng 12mg/L, 35-37oC. Tại phòng thí nghiệm, buồng trứng được cắt bỏ ống dẫn trứng, thấm máu và rửa lại bằng nước muối sinh lý như trên 3-4 lần. Từ bước này, tế bào trứng được thu trong tủ hút vô trùng, nhiệt độ 37oC.
Tế bào trứng lợn được thu bằng phương pháp hút nang. Dùng xi lanh loại 5 ml, kim cỡ 23G, nhẹ nhàng chọc vào nang trứng để hút tế bào trứng. Chỉ thu trứng từ những nang trứng có đường kính nang từ 2mm trở lên. Sau khi hút nang, hỗn hợp tế bào trứng - dịch nang trứng được đổ ra đĩa petri đường kính 9mm. Trứng được thu dưới kính hiển vi Nikon có độ phóng đại 8-20 lần. Môi trường thu trứng là môi trường 199 in air. Tế bào trứng được rửa 3-4 lần bằng môi trường thu trứng.
Phương pháp phân loại chất lượng trứng
Tế bào trứng được phân loại theo phương pháp của Leinfried và First và cs, (1979) trước khi trứng được đưa vào môi trường nuôi chính thức. Thời gian hút trứng ra khỏi buồng trứng đến khi phân loại trứng tiến hành càng nhanh càng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
tốt để chất lượng của trứng không ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ, ánh sáng.
Trứng loại A: Có trên 3 lớp tế bào Cumullus bao quanh trứng, các lớp tế bào cumullus này phải dày, đều đặn, đồng nhất và liên kết chặt chẽ với nhau, Tế bào trứng phải có nguyên sinh chất đồng đều, toàn bộ trứng nhìn trong và đầy đặn.
Trứng loại B: Có từ 2 - 3 lớp tế bào Cumullus bao quanh trứng, các lớp tế bào này liên kết không chặt chẽ, có nơi bị mất 1 phần tế bào. Nguyên sinh chất đồng đều nhưng hơi tối màu ở vùng ngoại vi trứng. Toàn bộ trứng nhìn kém trong và ít đày đặn hơn.
Trứng loại C: Có ít hoặc không có tế bào Cumullus bao quanh (trứng trần). Nguyên sinh chất không đồng đều hoặc màu tối có thể bị tan rã hoặc trương to.
Chỉ những trứng loại A, B mới được đưa vào nuôi thành thục và sử dụng trong các thí nghiệm.
Phương pháp nuôi thành thục tế bào trứng lợn in vitro (In vitro maturation - IVM)
Tế bào trứng lợn sau khi thu và phân loại được nuôi trong môi trường nuôi thành thục. Môi trường nuôi thành thục trứng lợn là môi trường TCM 199 có bổ sung 10% FBS (Fetal bovine serum – Huyết thanh thai bò).
Thời gian thành thục in vitro của tế bào trứng lợn là 44-48 giờ. Điều kiện tủ nuôi là 38,5oC, 5% CO2.
Trứng lợn thành thục được đánh giá bằng sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (polar body - pb), hoặc trạng thái nhận ở giai đoạn trung kỳ (metaphase).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Nồng độ GSH nội bào được đo như sau: Với mỗi lần, cho dịch chứa 10 – 15 trứng đã nuôi thành thục vào trong 5µl dung dịch đệm muối phosphate 0,2M chứa 10 mM Na2-EDTA (pH 7,2) và 5 µl dung dịch acid phosphoric 1,25M trong các ống nhỏ, và sau đó tất cả trứng được đông lạnh ở -80oC. Nồng độ GSH trong trứng được xác định bởi phân tích sự tái sản xuất acid dithionitrobenzoic- men khử glutathione disulphide. Mẫu được giải đông, và 175 µl đệm muối phosphate chứa 0,33 mg/ml nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH; Sigma), 25 µl của dung dịch DTNB 6 mM (Wako) và 40 µl nước được thêm vào mỗi ống mẫu. Mẫu được làm ấm ở nhiệt độ phòng trong 15 phút và phân tích được tiến hành với việc thêm 5 µl men khử glutathione disulphide 125 IU (Wako). Khả năng hút được đo 5 lần bởi dụng cụ đo ảnh phổ (DU7500; Beckman Coulter, Fullerton, CA, Mỹ) ở 30 giây, bước sóng 412nm. Một chuẩn GSH và các mẫu GSH được phân tích. Các chuẩn được chuẩn bị cho mỗi phân tích, nồng độ GSH tổng số /mẫu được xác định từ đường cong chuẩn của GSH. Nồng độ GSH / trứng được tính bằng cách chia nồng độ tổng số/ số lượng trứng của mẫu.
Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi thành thục in vitro (IVM)
Có hai phương pháp đánh giá thành thục của tế bào trứng lợn: Phương pháp soi thể cực thứ nhất và phương pháp đánh giá các giai đoạn phát triển của nhân trứng.
Phương pháp tách soi thể cực thứ nhất
Phương pháp soi thể cực được tiến hành theo phương pháp của Leibfried và Frist (1979). Để có thể soi được thể cực thứ nhất cần nhất là phải loại bỏ hết tế bào cumulus xung quanh trứng sau khi nuôi.
Trứng lợn sau khi nuôi thành thục được tách cumulus bằng cách chuyển các tế bào trứng vào trong giọt men Hyaluroindaza (một loại men của tinh trùng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
tiết ra có tác dụng phá vỡ tế bào cumulus để tinh trùng có thể thâm nhập vào trong tế bào trứng). Sau khoảng 5 -7 phút để trong tủ ấm dùng pipet hút các tế bào trứng vào và sục nhẹ nhàng để tách các tế bào cumulus mà không làm tổn hại tới tế bào trứng. Sau khi tế bào cumulus được tách sạch, trứng được rửa lại 3-4 lần bằng môi trường có chứa Hepes. Sau đó trứng được soi dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 - 100 lần để tìm thể cực.
Phương pháp đánh giá giai đoạn phát triển của nhân
Tế bào trứng sau khi được tách sạch tế bào cumulus, được cố định trên tiêu bản sử dụng phiến kính, tạo hai đường bao theo chiều dọc phiến kính bằng hỗn hợp vaseline-parafin, sau đó phủ lamen lên tế bào trứng. Dùng bút chì ấn nhẹ để cố định tế bào trứng mà không làm tổn hại hay vỡ tế bào trứng. Tiêu bản sau đó được ngâm trong dung dịch cố định Ethanol/ Acid acetic (3 : 1) tối thiểu 4 ngày, sau đó tiến hành nhuộm bằng thuốc nhuộm Orcein 1% khoảng 5 - 7 phút. Tiếp theo thuốc nhuộm được rửa sạch bằng dung dịch Aceto : Glycerol (Acid acetic : glycerol : nước = 1 : 1 : 3). Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100 - 400 lần. Dựa vào hình thái của nhân để đánh giá giai đoạn phát triển của nhân tế bào trứng theo phương pháp của (Leibfried - Rutledge và cs, 1986). Có ba giai đoạn phát triển chính của nhân:
Trứng chưa thành thục (Germinal Vesicle -GV): Màng nhân chưa tan, thấy rõ nhân
Trứng bắt đầu thành thục ( Metaphase I - MI): Màng nhân tan, Nhiễm sắc thể ở giai đoạn Metaphase I
Trứng thành thục (Metaphase II - MII): Trứng ở giai đoạn thành thục, có thể thụ tinh, nhiễm sắc thể ở giai đoạn Metaphase II.
Phương pháp thụ tinh ống nghiệm tế bào trứng lợn với tinh trùng đông lạnh, giải đông.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Qui trình thụ tinh ống nghiệm tế bào trứng lợn với tinh trùng đông lạnh – giải đông gồm các bước như sau:
Chuẩn bị tế bào trứng lợn thành thục
Trứng sau nuôi (IVM) 44-48 giờ có thể dùng cho thụ tinh ống nghiệm Tách qua trứng bằng men Hyaluronidase để loại bỏ tế bào cumulus bao quanh trứng, giúp quá trình thụ tinh dễ dàng hơn. Trứng được rửa lại môi trường 199 Hepes. Tế bào trứng sau đó được rửa lại trong 2ml dung dịch thụ tinh (Fertilization medium– FM) và chuyển vào giếng chứa 450ul môi trường thụ tinh (FM).
Chuẩn bị tinh trùng cho thụ tinh ống nghiệm Các loại môi trường
Môi trường hoạt hóa tinh : TCM 199 pH 7,8
Môi trường thụ tinh (FM)
Nước muối 3%: Dùng để đếm tinh
Giải đông tinh
Chuẩn bị một cốc nước 37oC, lấy cọng rạ từ ngân hàng tinh đông lạnh ra, dùng giấy lau lớp tuyết trên bề mặt cọng rạ rồi nhanh chóng chuyển cọng rạ vào cốc nước ấm.
Dùng kéo vô trùng, cắt hai đầu cọng rạ để giải phóng tinh trùng đông lạnh lẫn chất bảo quản vào trong eppendorf có chứa môi trường hoạt hóa tinh (môi trường 199 pH 7,8) đã được làm ấm. Dùng pipet sục nhẹ rồi đưa vào ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 2 phút.
Kiện toàn năng lực thụ tinh
Tinh sau khi ly tâm, hút bỏ phần môi trường phía trên, thêm 60µl môi trường hoạt hóa tinh, để vào tủ ấm 385oC. Kiểm tra khả năng sống, vận động và hoạt lực của tinh trùng. Hoạt lực của tinh trùng 30% trở lên mới sử dụng trong thụ tinh ống nghiệm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Tính toán để có nồng độ tinh cuối cùng trong giếng thụ tinh là 105 tinh trùng/ml
Ủ trứng với tinh trùng.
Cho trứng và tinh trùng kết hợp với nhau. Thời gian ủ trứng với tinh trùng là 3 giờ ở điều kiện 38,5oC, 5% CO2
Phương pháp nuôi phôi
Sau 3 giờ thụ tinh, trứng được tách sạch tế bào cumulus (cận noãn) và tinh trùng xung quanh, rửa bằng môi trường 199 bổ sung Hepes, rửa lại bằng môi trường nuôi phôi và chuyển vào môi trường nuôi phôi. Phôi được nuôi trong tủ nuôi vô trùng, điều kiện 38,5oC, 5% CO2
Phôi được nuôi trong môi trường nuôi có bổ sung pyruvat từ ngày 0 đến ngày 2. Phôi được chuyển sang môi trường có bổ sung Glucose từ ngày 2 đến ngày 6. Kiểm tra kết quả, đánh giá chất lượng phôi ở ngày thứ 6. Ngày thụ tinh được tính là ngày 0
Phương pháp đánh giá chất lượng phôi nang
Chất lượng phôi nang được đánh giá qua số lượng tế bào/phôi nang. Phôi nang thu ở ngày thứ 6-7 sau thụ tinh ống nghiệm được cố định trên tiêu bản, đưa vào dung dịch ethanol: acid acetic theo tỷ lệ 3:1 về thể tích (v/v) trong 3-4 ngày. Tiêu bản được nhuộm bằng thuốc nhuộm aceto-orcein 1% trong 5-7 phút. Sau đó tiêu bản được soi dưới kính hiển vi có độ phóng đại 200-400 lần. Nhân tế bào bắt màu đỏ với thuốc nhuộm orcein. Số tế bào/phôi nang được đếm 3 lần sau đó lấy kết quả trung bình.
Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Minitab 16 và phân tích phương sai Anova. Sự khác biệt có ý nghĩa với P<0,05.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn