Phần I. Ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục trong các nồng độ oxy khác nhau tới nồng độ GSH của trứng và khả năng thành thục của tế bào trứng lợn
Ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục trong các nồng độ oxy khác nhau tới khả năng thành thục của tế bào trứng lợn.
Tế bào trứng được nuôi trong môi trường nuôi thành thục có bổ sung cysteine ở các mức nồng độ từ 0,05 tới 0,6 mM ở nồng độ oxy là 5%. Môi trường đối chứng không bổ sung cysteine (0 mM). Kết quả thí nghiệm thể hiện ở Bảng 1
Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng độ cysteine lên sự thành thục in vitro tế bào trứng lợn ở nồng độ oxy 5%. Nồng độ Cysteine (mM) Số lần lặp lại thí nghiệm Số trứng thí nghiệm Số trứng thành thục (5% O2)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 0 3 90 65 (72,2 ± 1,4) 0,05 3 90 62 (68,9 ± 2,3) 0,1 3 92 67 (72,8 ± 1,7) 0,2 3 93 66 (71.0 ± 1,5) 0,6 3 90 68 (75.6 ± 2,1)
Kết quả ở Bảng 1 cho thấy, tỷ lệ trứng thành thục trong môi trường không bổ sung cysteine là 72,2%. Trong khi đó, tỷ lệ thành thục của tế bào trứng trong môi trường bổ sung cysteine ở nồng độ (0,05; 0,1; 0,2; 0,6mM) là (68,9; 72,8; 71,0 và 75,6%) theo thứ tự. Sự khác biệt về tỷ lệ thành thục trứng lợn ở các nhóm là không có ý nghĩa thống kê P>0,05.
Như vậy, ở nồng độ oxy thấp (5%) thì việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi không ảnh hưởng tới khả năng thành thục tế bào trứng lợn. Câu hỏi được đặt ra là nếu tế bào trứng được nuôi ở nồng độ oxy cao (20%) thì kết quả sẽ như thế nào. Để trả lời câu hỏi này, thí nghiệm tiếp theo được thực hiện trong điều kiện nuôi là 20% oxy. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 2
Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ cysteine lên sự thành thục in vitro tế bào trứng lợn ở nồng độ oxy 20 % Nồng độ Cysteine (mM) Số lần lặp lại thí nghiệm Số trứng thí nghiệm Số trứng (%) thành thục
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 0 3 92 41 (44,6± 2,5)a 0,05 3 94 41 (43,6 ± 1,8)a 0,1 3 90 45(50,0 ± 1,5)b 0,2 3 90 68 (75,6 ± 2,7)c 0,6 3 91 66 (72,5 ± 2,0)c
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa P<0,05
Kết quả ở Bảng 2 cho thấy, tỷ lệ thành thục tế bào trứng lợn ở nhóm đối chứng (không bổ sung cysteine) và nhóm bổ sung cysteine ở nồng độ rất thấp 0,05 mM lần lượt là (44,6 và 43,6%), sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê P>0,05. Tuy nhiên tỷ lệ thành thục của hai nhóm này lại thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm bổ sung (0,1; 0,2 và 0,6 mM cysteine) theo thứ tự là (50,0; 75,6 và 72,5%), P<0,05. Hơn nữa, việc bổ sung cysteine ở hai mức nồng độ (0,2 và 0,6 mM cysteine) cho tỷ lệ thành thục tương đương nhau, P>0,05 và cao hơn so với tỷ lệ thành thục trứng lợn ở mức nồng độ cysteine bổ sung 0,1 mM, P<0,05.
Qua bảng 1 và 2 ta thấy, khi tế bào trứng lợn được nuôi trong điều kiện nồng độ oxy thấp (5%) thì việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi không ảnh hưởng tới khả năng thành thục tế bào trứng lợn. Tuy nhiên, khi tế bào trứng lợn được nuôi trong điều kiện nồng độ oxy cao (20%) thì việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi có ảnh hưởng rõ rệt tới tỷ lệ thành thục tế bào trứng lợn, cụ thể là làm tăng khả năng thành thục của tế bào trứng lợn. Lý giải điều này có thể do, ở điều kiện nồng độ oxy cao (20%), tế bào bị stress và việc bổ sung cysteine bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa. Còn ở điều kiện oxy thấp (5%), điều kiện này được cho là có lợi trong bảo vệ tế bào (Meister 1976, 1983) và giao tử động vật có vú (Luberda, 2005) khỏi stress oxy hóa.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Ảnh hưởng của nồng độ oxy trong điều kiện nuôi tới khả năng thành thục của tế bào trứng lợn được thể hiện qua Biểu đồ 1
Biểu đồ 1. So sánh ảnh hưởng việc bổ sung cysteine ở mức nồng độ oxy khác nhau tới khả năng thành thục của tế bào trứng lợn
Qua biểu đồ ta thấy, tế bào trứng nuôi trong điều kiện không được bổ sung cysteine (đối chứng) hoặc bổ sung cysteine ở nồng độ thấp (0,05 và 0,1 mM) cho tỷ lệ thành thục tế bào trứng trong điều kiện nuôi 20% oxy thấp hơn so với tỷ lệ thành thục tế bào trứng được nuôi trong điều kiện 5% oxy.
Tuy nhiên, khi tăng nồng độ cysteine bổ sung vào môi trường nuôi lên (0,2 và 0,6 mM) thì tỷ lệ thành thục của tế bào trứng nuôi trong điều kiện 20% oxy tăng đáng kể, đạt tương đương so với trứng nuôi trong điều kiện 5% oxy. Điều này có thể giải thích là do cysteine giúp bảo vệ tế bào trứng khỏi stress oxy hóa. Tuy nhiên, ở mức nồng độ cysteine bổ sung thấp (0,05 và 0,1 mM) thì
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
không có tác dụng này. Bổ sung cysteine vào môi trường nuôi ở nồng độ 0,2 và 0,6 mM là phù hợp cho sự thành thục in vitro của tế bào.
Ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục trong các nồng độ oxy khác nhau tới nồng độ Glutahinone (GSH) tế bào trứng lợn
Cysteine là một amino acid then chốt cấu thành glutathione (GSH). GSH là chất có đóng vai trò quan trọng trong cung cấp một môi trường thu nhỏ để bảo vệ tế bào chống lại tác động có hại của tổn thương oxy hóa (Meister vcs, 1983), đặc biệt là khi những tế bào được nuôi dưới điều kiện có nồng độ oxy cao. Sự giảm GSH trong IVM gây cản trở sự hình thành tiền nhân đực do không có sự tháo rời đuôi tinh trùng và ngăn cản sự ghép tiền nhân trong quá trình thụ tinh (Sutovsky và Schatten, 1997). Do đó, đánh giá mức GSH trong trứng là một trong những cách dễ dàng nhất để tăng cơ hội thành công của phát triển phôi lợn.
Bảng 3. Ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine tới nồng độ Glutathione trong tế bào trứng lợn sau khi nuôi thành thục in vitro ở nồng độ oxy 5%
STT Nồng độ cysteine (mM) Nồng độ Glutathione trong trứng
(pmol/trứng) (5% O2) 1 0 3,4 ± 0,5a 2 0,05 8,6 ± 0,6b 3 0,1 8,9 ± 0,4b 4 0,2 9,1 ± 0,3bc 5 0,6 9,6 ± 0,5c
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Qua bảng 3 ta thấy, nồng độ Glutathione (GSH) trong tế bào trứng lợn nuôi trong điều kiện 5% oxy trung bình ở mức 3,4 pmol/trứng (đối chứng). Khi bổ sung cysetein vào môi trường nuôi thành thục, nồng độ này tăng lên rõ rệt P<0,05. Nồng độ GSH trong tế bào trứng nuôi trong môi trường bổ sung cysteine ở nồng độ (0,05; 0,1; 0,2 mM) tương đương nhau, tương ứng là (8,6; 8,9 và 9,1 pmol/trứng), P>0,05 và cao hơn có ý nghĩa so với nhóm đối chứng không bổ sung cysteine (3,4 pmol/trứng) P<0,05. Ngoài ra, nồng độ GSH trong tế bào trứng nuôi trong môi trường bổ sung 0,6 mM cysteine là 9,6 pmol/trứng, tương đương so với trứng nuôi trong môi trường bổ sung 0,2 mM cysteine (P>0,05) và cao hơn nồng độ GSH trong tế bào trứng ở tất cả các nhóm còn lại, P<0,05.
Như vậy, ở nồng độ nồng độ oxy thấp (5%) thì việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi làm tăng rõ rệt nồng độ GSH trong tế bào trứng lợn.
Bảng 4. Ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi tới nồng độ Glutathione trong trứng ở nồng độ 20% oxy
STT Nồng độ cysteine (mM) Nồng độ Glutathione trong trứng
(pmol/trứng) (20% oxy) 1 0 3,6 ± 0,2a 2 0,05 4,3 ± 0,5a 3 0,1 8,5 ± 0,5b 4 0,2 8,5 ± 0,3b 5 0,6 9,4 ± 0,4c
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Qua bảng 4 ta thấy, nồng độ GSH trong tế bào trứng lợn nuôi trong môi trường không bổ sung cysteine và bổ sung 0,05 mM cysteine ở điều kiện 20% oxy là tương đương nhau, tương ứng là (3,6 và 4,3 pmol/trứng) P>0,05. Khi tăng nồng độ cysteine lên (0,1 và 0,2 mM) thì nồng độ GSH cũng tăng lên. Cụ thể là khi bổ sung cysteine ở mức (0,1 và 0,2 mM) thì nồng độ GSH đều đạt 8,5 pmol/trứng và cao hơn có ý nghĩa so với nhóm đối chứng và nhóm bổ sung 0,05 mM cysteine. Đặc biệt, khi bổ sung cysteine ở mức 0,6 mM thì nồng độ GSH trong tế bào trứng đạt tới 9,4 pmol/trứng, cao hơn tất cả các nhóm khác, P<0,05.
Như vậy, việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi từ mức 0,1 tới 0,6 mM giúp tăng nồng độ GSH trong tế bào trứng. Đây là chỉ tiêu quan trọng giúp tăng cơ hội thành công của quá trình phát triển phôi lợn.
Biểu đồ 2. So sánh ảnh hưởng việc bổ sung cysteine ở mức nồng độ oxy khác nhau tới nồng độ GSH tế bào trứng lợn.
Phần II. Ảnh hưởng của việc bổ sung tế bào đệm tới sự phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Việc sử dụng tế bào đệm nuôi kết hợp với phôi như một hình thức bắt chước điều kiện cơ thể sống. Ống dẫn trứng động vật có vú cung cấp các điều kiện sinh lý cho sự phát triển phôi ở giai đoạn sớm trong cơ thể và góp phần quan trọng trong sự thành công của việc mang thai (Pushpakumara, 2002).
Trong nghiên cứu này, thí nghiệm được thiết kế sử dụng ba loại tế bào đệm là tế bào sợi thai chuột, tế bào ống dẫn trứng lợn và tế bào tử cung lợn. Kết quả về ảnh hưởng của việc bổ sung tế bào đệm tới khả năng phân chia của phôi thụ tinh ống nghiệm được thể hiện ở Bảng 5.
Bảng 5. Ảnh hưởng của việc bổ sung tế bào đệm tới khả năng phân chia của trứng lợn thụ tinh ống nghiệm Loại tế bào đệm Số lần lặp lại thí nghiệm Số trứng thí nghiệm Số trứng phân chia Tỷ lệ phân chia (%) Đối chứng 8 458 275 (60,0 ± 3,5) Tế bào sợi thai
chuột 8 406 274 (66,6 ± 7,3) Tế bào ống dẫn trứng lợn 8 433 280 (64,6 ± 5,2) Tế bào tử cung lợn 8 358 243 (67,6 ± 1,2)
Kết quả thí nghiệm cho thấy, tỷ lệ phân chia của phôi sau thụ tinh ống nghiệm tương tự nhau giữa nhóm không bổ sung tế bào đệm (đối chứng) và các nhóm thí nghiệm nuôi với tế bào đệm. Tỷ lệ phân chia của phôi sau thụ tinh ống nghiệm dao động từ 60,03% đến 67,58%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Có một điều đáng chú ý là các sản phôi lợn ống nghiệm nếu nuôi trong điều kiện thông thường, phôi thường bị dừng lại ở giai đoạn 2-4 tế bào và không phát triển tiếp được. Kết quả về ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phát triển phôi đến giai đoạn 2-16 tế bào được thể hiện ở bảng 6
Bảng 6. Ảnh hưởng của tế bào đệm tới khả năng phát triển phôi tới giai đoạn 2- 16 tế bào Loại tế bào đệm Số lần lặp lại thí nghiệm Số phôi giả định Số phôi 2- 16 tế bào Tỷ lệ phôi 2- 16 tế bào (%) Đối chứng 8 275 153 (57,1 ± 3,1)a Tế bào sợi thai
chuột 8 274 116 (39,4 ± 6,2) ab Tế bào ống dẫn trứng lợn 8 280 82 (29,2 ± 4,8)b Tế bào tử cung lợn 8 243 72 (30,5 ± 3,9)b
Các chữ cái khác nhau trong cùng một hàng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với P<0,05
Kết quả nghiên cứu cho thấy, phôi nuôi trong môi trường không có tế bào đệm, tỷ lệ phôi chỉ phát triển đến giai đoạn 2-16 tế bào khá cao (57,1%). Tuy nhiên, khi phôi được nuôi với tế bào biểu mô ống dẫn trứng và tế bào tử cung, tỷ lệ phôi dừng lại ở giai đoạn 2-16 tế bào tương ứng chỉ còn là (29,2% và 30,5%).
Trong khi đó, tỷ lệ phôi giai đoạn 2-16 tế bào ở nhóm phôi được nuôi với tế bào biểu mô ống dẫn trứng và tế bào tử cung tương đương nhau (29,2% và 30,5%, theo thứ tự) và thấp hơn có ý nghĩa so với tỷ lệ này ở nhóm đối chứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Không có sự khác biệt về tỷ lệ phôi giai đoạn 2-16 tế bào giữa nhóm phôi nuôi với tế bào sợi thai chuột và nhóm đối chứng cũng như với hai nhóm nuôi kết hợp còn lại.
Tóm lại, tế bào sợi thai chuột và tế bào tử cung lợn giúp hỗ trợ phôi lợn in vitro phát triển vượt qua giai đoạn 2-16 tế bào.
Sự tương quan ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phân chia và phát triển phôi đến giai đoạn 2-16 tế bào thể hiện ở Biểu đồ 3.
Biểu đồ 3. So sánh ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phân chia và sự phát triển phôi tới giai đoạn 2-16 tế bào của trứng lợn TTON
Tỷ lệ hình thành phôi nang của trứng thụ tinh ống nghiệm là yếu tố quan trọng đánh giá hiệu suất tạo phôi in vitro ở lợn. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung tế bào đệm tới sự hình thành phôi nang được thể hiện ở bảng 7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Bảng 7. Ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm đến giai đoạn phôi nang
Loại tế bào đệm Số lần lặp lại thí nghiệm Số phôi giả định Số phôi nang (blastocyst) Tỷ lệ phôi nang (%) Đối chứng 8 275 48 (16,8 ± 3,1)b Tế bào sợi thai chuột 8 274 69 (24,6 ± 3,1)ab Tế bào ống dẫn trứng lợn 8 280 69 (24,4 ± 2,2) ab Tế bào nội mạc tử cung lợn 8 243 66 (28,5 ± 3,5) a
Các chữ cái khác nhau trong cùng một hàng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với P<0,05
Kết quả thí nghiệm cho thấy, phôi nuôi kết hợp với tế bào sợi thai chuột và tế bào biểu mô ống dẫn trứng cho tỷ lệ hình thành phôi nang tương đương (24,6% sv 24,4%) và tương đương so với đối chứng (16,8%). Trong khi đó, tỷ lệ hình thành phôi nang ở nhóm phôi được nuôi kết hợp với tế bào nội mạc tử cung lợn là 28,5%, cao hơn có ý nghĩa so với tỷ lệ này ở nhóm đối chứng, P<0,05. Không có sự khác biệt trong tỷ lệ hình thành phôi nang ở các nhóm nuôi phôi với tế bào đệm (P>0,05).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Như vậy việc nuôi kết hợp phôi lợn in vitro với tế bào nội mạc tử cung lợn là biểu hiện rõ ràng nhất, cho tỷ lệ phôi nang cao hơn rõ rệt so với đối chứng (P<0,05). Điều này có thể lý giải là tế bào nội mạc tử cung lợn tạo điều kiện tương tự với điều kiện phát triển phôi trong cơ thể. Tế bào này có thể tiết ra chất kích thích sự phát triển phôi đến giai đoạn phôi nang.
Tương quan giữa ảnh hưởng của tế bào đệm tới tỷ lệ phân chia, tỷ lệ hình thành phôi nang và tỷ lệ phôi 2-16 tế bào với tỷ lệ hình thành phôi nang được thể hiện ở Biểu đồ 4 và 5.
Biểu đồ 4. So sánh ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phân chia và hình thành phôi nang của trứng lợn TTON
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Biểu đồ 5. So sánh ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phát triển phôi đến giai đoạn 2-16 tế bào và hình thành phôi nang của trứng lợn TTON
Ngoài tỷ lệ hình thành phôi nang thì chất lượng phôi nang (số tế bào / phôi nang) cũng là yếu tố quan trong đánh giá sự thành công của hiệu suất tạo phôi in vitro ở lợn. Kết quả về ảnh hưởng của việc bổ sung tế bào đệm tới chất lượng phôi nang được thể hiện ở bảng 8.
Bảng 8. Ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm đến chất lượng phôi nang
Loại tế bào đệm Số lần lặp lại thí nghiệm Số phôi nang (blastocyst) Số tế bào trung bình/phôi nang Đối chứng 8 48 26,6 ± 1,5 Tế bào sợi thai chuột 8 69 27,3 ± 1,5 Tế bào ống dẫn trứng lợn 8 69 29,9 ± 1,9 Tế bào tử cung lợn 8 66 32,3 ± 2,3