Lấy 10 mL mẫu lỏng vào ống ly tâm; thêm 5mL MeOH, lắc đều trên máy lắc votex, thêm 20 mL nước cất, rung siêu âm 20 phút. Sau đó, chuyển toàn bộ lượng mẫu vào bình định mức 100 mL, thêm 2 mL dung dịch carrez 1 (15g K4[Fe(CN)6].3H2O trong 100 mL nước cất), lắc đều, tiếp tục thêm 2 mL dung dịch carrez 2 (30g ZnSO4.7H2O trong 100 mL nước cất), lắc đều, định mức đến vạch bằng nước cất 2 lần rồi lọc qua giấy lọc băng xanh. Dung dịch thu được tiếp tục được lọc qua màng lọc whatman 0,45 µm và định lượng bằng phương pháp HPLC với detector DAD ở bước sóng 210nm, dựa vào thời gian lưu, diện tích pic để định tính và định lượng chất phân tích.
Hàm lượng chất phân tích được tính theo công thức: X(mg/100g) = Cm . m Vm . 1000 100 (2.10), trong đó: Cm : Nồng độ tính theo đường chuẩn (ppm).
Vm: Thể tích dung dịch chiết sau khi xử lý mẫu(mL). m : Khối lượng mẫu cân ban đầu (g)
Hình 2.2. Sơ đồ phân tích saccharin và aspartame bằng phương pháp HPLC 2.4. Phương pháp xử lý số liệu
- Sử dụng các phần mềm tính toán Microsoft Excel, máy tính Casio 580MS.
- Sử dụng phần mềm của thiết bị để tính toán thời gian lưu, diện tích peak, chiều cao peak và tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu bằng phần mềm của thiết bị.
Mẫu cân khoảng 2-5g/ hoặc 5-10mL
2mL Dung dịch Carrez 1 Lắc vortex 2mL Dung dịch Carrez 2 Lắc vortex
HPLC 30mL H2O Bình định mức 100 mL Định mức bằng nước Lọc qua màng lọc whatman 0,45 µm Đồng nhất mẫu
Rung siêu âm 30 phút
5 mL MeOH Lắc vortex Rung siêu âm
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ưu xác định Aspartame và Saccharin bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao Saccharin bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao
3.1.1. Lựa chọn detector
Detector là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Saccharin và aspartame là những chất có khả năng hấp thụ rất tốt ánh sáng trong vùng tử ngoại, do trong cấu tạo phân tử của các chất phân tích này đều có liên kết 𝜋. Vì vậy, detector DAD (diode array detector) và detector UV đều có thể được sử dụng cho việc định tính và định lượng các chất trên. Tuy nhiên detector DAD cho phép đo đồng thời tại nhiều bước sóng (đo phổ UV) trong quá trình sắc ký. Để thuận lợi cho phép phân tích xác định đồng thời saccharin và aspartame bằng phương pháp HPLC, chúng tôi lựa chọn detector DAD để thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu, khảo sát.
3.1.2. Khảo sát lựa chọn bước sóng
Để xác định bước sóng hấp thụ quang cực đại của các chất đang nghiên cứu, chúng tôi tiến hành quét sắc ký đồ của saccharin và aspartame trong khoảng bước sóng 190 ÷ 400 nm, với detector DAD, nồng độ saccharin và aspartame bằng nhau và bằng 10 ppm. Kết quả được thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1. Sắc ký đồ xác định bước sóng hấp thụ quang cực đại của saccharin và aspartame
Sac
A
Từ kết quả khảo sát trên hình 3.1, chúng tôi nhận thấy ở bước sóng 210 nm đồng thời xuất hiện pic của saccharin và aspartame lần lượt tách ra ở các thời gian lưu là 6,48 và 27,7 phút. Vì vậy chúng tôi lựa chọn bước sóng 210 nm để xác định đồng thời SCR và ASP trong các thí nghiệm nghiên cứu, khảo sát.
3.1.3. Lựa chọn cột tách
Cột tách là trái tim của hệ thống HPLC, nó quyết định quá trình tách có độ phân giải tốt hay không. Căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân tích để lựa chọn cột tách phù hợp.
Do cấu trúc phân tử saccharin, aspartame là chất phân cực yếu. Vì vậy, để tách được các chất này nên chọn pha tĩnh là pha ngược. Mặt khác, sử dụng chất nhồi pha ngược thì hệ dung môi là những chất phân cực nên kinh tế hơn, ổn định hơn và không phụ thuộc và nhiệt độ, độ ẩm như chất nhồi của pha thường. Sắc đồ hỗn hợp các chất được phân tích bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm) được thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2. Sắc đồ phân tích hỗn hợp chất bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm)
ĐKTN: thành phần pha động NaH2PO4 : ACN = 90 : 10 (v/v), bước sóng 210 nm
Cột C18 (250mm× 4,6mm × 5μm) có hình ảnh pic tách tốt, ít doãng, nhọn và cân đối, thích hợp cho phân tích được nhiều chất. Để thuận lợi cho quá trình phân tích, chúng tôi chọn sử dụng cột Agilent C18 (250mm× 4,6mm × 5μm) để thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu, khảo sát.
3.1.4. Lựa chọn pha động
Để tách saccharin, aspartame ra khỏi các chất cản trở trong nền mẫu và định lượng nó dễ dàng và chính xác, pha động sử dụng phải phân cực. Dựa trên độ phân cực của các dung môi ở bảng 2.1 có thể chọn dung môi có độ phân cực phù hợp.
Qua nghiên cứu các tài liệu tham khảo [4], [8], [12], [13], [20]… và quá trình tiến hành thực nghiệm sắc ký, chúng tôi chọn lựa chế độ chạy sắc ký pha động thành phần không đổi (isocratic) với thành phần pha động là NaH2PO4 và ACN; tỷ lệ thành phần pha động NaH2PO4 : ACN là 90 : 10 (V/V). Sắc đồ phân tích hỗn hợp SCR và ASP tại bước sóng 210nm, được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Sắc đồ phân tích hỗn hợp saccharin và aspartame
ĐKTN: thành phần pha động NaH2PO4 : ACN = 90 : 10 (v/v), bước sóng 210 nm,
3.1.5. Khảo sát pH của pha động
Nếu pH của pha động cao, aspartame sẽ bị phân hủy. pH của pha động chỉ nên trong khoảng 2-7, vì lớn hơn 7 hay nhỏ hơn 2 sẽ làm tăng độ tan của các hạt silic trên pha tĩnh. pH tốt nhất để tách các chất phân tích này là vùng axit vì ở vùng pH này, các chất phân tích tồn tại ở dạng axit nên hấp phụ trên pha tĩnh tốt hơn.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng bởi pH của pha động (dung dịch hỗn hợp NaH2PO4 (pH = 3; 3,5; 4,0; 4,5) và ACN với tỷ lệ NaH2PO4 : ACN = 90 : 10 (v/v)), được thể hiện trên các hình 3.4-3.7 và bảng 3.1.
Hình 3.4. Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và aspartame tại pH = 3,0
ĐKTN: thành phần pha động NaH2PO4 : ACN = 90 : 10 (v/v), bước sóng 210 nm, tốc dộ dòng là 1 mL/phút, thể tích bơm mẫu 10 µL
Hình 3.5. Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và aspartame tại pH = 3,5
ĐKTN: thành phần pha động NaH2PO4 : ACN = 90 : 10 (v/v), bước sóng 210 nm, tốc dộ dòng là 1 mL/phút, thể tích bơm mẫu 10 µL
Hình 3.6. Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và aspartame tại pH = 4,0
ĐKTN: thành phần pha động NaH2PO4 : ACN = 90 : 10 (v/v), bước sóng 210 nm, tốc dộ dòng là 1 mL/phút, thể tích bơm mẫu 10 µL
Hình 3.7. Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và aspartame tại pH = 4,5
ĐKTN: thành phần pha động NaH2PO4 : ACN = 90 : 10 (v/v), bước sóng 210 nm, tốc độ dòng là 1 mL/phút, thể tích bơm mẫu 10 µL
Bảng 3.1. Giá trị diện tích pic của saccharin và aspartame phụ thuộc vào pH của dung dịch đệm
pH Diện tích pic (mAu)
Saccharin Aspartame
3,0 11993 2283
3,5 111140 24785
4,0 289818 66659
4,5 28651422 6788626
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, ở các dung dịch đệm NaH2PO4 có pH = 3 - 4, đường vân trong sắc ký đồ không đều, pic của saccharin và aspartame không rõ nét, không cân đối, chân đường nền cao, diện tích pic nhỏ. Với pH = 4,5 pic của saccharin và aspartame nhọn và cân đối hơn, diện tích pic cao hơn, chân đường nền ổn định hơn so với các giá trị tương ứng ở pH = 3 – 4. Trên cơ sở đó, chúng tôi lựa chọn pH của dung dịch đệm NaH2PO4 là 4,5 để thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu.
Như vậy, qua các thí nghiệm khảo sát các điều kiện tối ưu cho phép phân tích xác định saccharin và aspartame bằng phương pháp HPLC, chúng tôi lựa chọn các điều kiện thí nghiệm thích hợp thể hiện trên bảng 3.2.
Bảng 3.2. Các điều kiện thí nghiệm thích hợp cho phép phân tích xác định saccharin và aspartame bằng phương pháp HPLC
Các điều kiện Kết quả khảo sát và lựa chọn
Detector DAD Bước sóng 210 nm Cột tách Agilent C18 (250mm× 4,6mm × 5μm) Pha động Dung dịch hỗn hợp NaH2PO4 : ACN = 90 : 10 (v/v) pH dung dịch đệm pha động 4,5
3.2. Kết quả xác định độ lặp, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp lượng của phương pháp
3.2.1. Kết quả nghiên cứu tính phù hợp của hệ thống
Để nghiên cứu tính phù hợp của hệ thống, chúng tôi tiến hành bơm 6 lần hỗn hợp dung dịch chuẩn saccharin và aspartame cùng nồng độ 10ppm, tính độ lặp lại của thời gian lưu (tR), diện tích pic, kết quả thu được trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả tính toán sự phù hợp của hệ thống Số lần
bơm
Thời gian lưu (phút) Diện tích peak (mAU)
Sac Asp Sac Asp
1 6,515 27,721 626121 147866 2 6,526 27,719 627271 148614 3 6,540 27,730 626272 147977 4 6,547 27,708 626571 147844 5 6,493 27,650 625907 149303 6 6.509 27,682 626236 148810 Xtb 6,522 27,702 626396 148810 SD 0,02 0,03 480 600 RSD(%) 0,307 0,109 0,077 0,405
Từ kết quả quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký cho thấy, độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của thời gian lưu và diện tích pic của các chất phân tích trong 6 lần thử là 0,077 ÷ 0,405%, giá trị này nằm trong khoảng cho phép theo AOAC. Điều này khẳng định hệ thống sắc ký phù hợp, ổn định, đảm bảo cho phép phân tích đồng thời saccharin và aspartame.
3.2.2. Độ đặc hiệu, tính chọn lọc của phương pháp
Để xác định độ đặc hiệu, tính chọn lọc của phương pháp, chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu trắng và mẫu trắng có thêm chất chuẩn saccharin, aspartame với nồng độ bằng nhau và bằng 10ppm, so sánh mẫu trắng và mẫu trắng có thêm chuẩn. Kết quả được thể hiện trên hình 3.8.
(A)
(B)
Hình 3.8. Sắc đồ của mẫu trắng (A) và mẫu trắng có thêm chuẩn (B)
ĐKTN: thành phần pha động NaH2PO4 : ACN = 90 : 10 (v/v), bước sóng 210 nm,tốc dộ dòng 1,0 mL/phút, thể tích bơm mẫu 10 µL; [SCA] = [ASP]= 10ppm
Từ kết quả phân tích trên hình 3.8, chúng tôi nhận thấy trên sắc đồ mẫu trắng (A) không xuất hiện pic tại các thời gian lưu của saccharin và aspartam. Còn trên sắc đồ mẫu trắng có thêm chuẩn (B) có xuất hiện các pic tại các thời gian lưu tương ứng của saccharin và aspartame. Như vậy phương pháp có tính đặc hiệu và chọn lọc đáp ứng yêu cầu.
Từ sắc đồ của mẫu trắng thêm chuẩn thể hiện ở hình 3.8, xác định hệ số tách và độ phân giải của 2 pic liền kề nhau, theo các phương trình:
- Độ phân giảiRS = (*) và hệ số tách α = ' ' RA RB t t (**) Kết quả được chỉ ra trên bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hệ số tách và độ phân giải của pic các chất phân tích
Thông số Độ phân giải (α)
Saccharin Aspartam
Thời gian lưu (phút) 6,159 27,698
Hệ số tách α 4,497
Độ rộng đáy pic (W) 1,0326 1,0791
Độ phân giải (RS) 20,4
Từ kết quả ở bảng 3.5 cho thấy hệ số tách của saccharin và aspartame lớn hơn 1,05; độ phân giải lớn hơn 1,5. Vậy các chất phân tích đã được tách khỏi nhau hoàn toàn, từ đó cho thấy mức độ chọn lọc của phương pháp phân tích là rất cao.
3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị đo
Chúng tôi tiến hành xác định giới hạn phát hiện của thiết bị đối với saccharin và Aspartame bằng cách tiến hành đo 6 lần (n=6) với thể tích của mẫu trắng là 10 μL, trong các điều kiện thí nghiệm đã khảo sát. Kết quả được thể hiện trên các hình 3.9, 3.10 và các bảng 3.5, 3.6. ) ( 2 / 1 B A RA RB W W t t
Hình 3.9. Sắc đồ LOD của thiết bị đối với saccharin
Hình 3.10. Sắc đồ LOD của thiết bị đối với aspartam Bảng 3.5. Giá trị xác định LOD của thiết bị đo với Saccharin
Mẫu Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAu) S/N
Mẫu 1 6,479 800 3,76 Mẫu 2 6,478 891 3,82 Mẫu 3 6,484 801 4,40 Mẫu 4 6,472 882 4,05 Mẫu 5 6,473 862 3,82 Mẫu 6 6,451 490 2,81
Bảng 3.6. Giá trị xác định LOD của thiết bị đo với Aspartame
Mẫu Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAu) S/N
Mẫu 1 26,759 2705 3,30 Mẫu 2 27,416 2445 3,33 Mẫu 3 27,449 2326 1,21 Mẫu 4 27,416 1476 2,64 Mẫu 5 26,759 2235 3,01 Mẫu 6 27,617 2681 2,70
Để tính giá trị LOQ của thiết bị đo với Saccharin và Aspartame, chúng tôi tiến hành bơm 6 lần hỗn hợp dung dịch chuẩn saccharin và aspartame cùng nồng độ lần lượt là 0,1ppm và 0,5ppm trong các điều kiện thí nghiệm đã khảo sát. Kết quả được thể hiện trên các bảng 3.7 và 3.8.
Bảng 3.7. Giá trị xác định LOQ của thiết bị đo với Saccharin Mẫu Thời gian lưu
(phút) Diện tích pic (mAu) Nồng độ (ppm) Mẫu Sac 1 6,459 5435 0,104 Mẫu Sac 2 6,469 5497 0,105 Mẫu Sac 3 6,440 6631 0,097 Mẫu Sac 4 6,438 6734 0,099 Mẫu Sac 5 6,443 6482 0,095 Mẫu Sac 6 6,433 6374 0,093 Giá trị trung bình 6,447 6192 0,099 %RSD 0,216 9,303 4,729 Max 6,469 6734 0,105 Min 6,433 5435 0,093 SD 0,014 576 0,005
Bảng 3.8. Giá trị xác định LOQ của thiết bị đo với Aspartame Mẫu Thời gian lưu
(phút) Diện tích pic (mAu) Nồng độ (ppm) Mẫu Asp 1 26,803 7217 0,478 Mẫu Asp 2 27,522 5422 0,500 Mẫu Asp 3 27,511 7123 0,471 Mẫu Asp 4 27,529 7671 0,508 Mẫu Asp 5 57,522 7065 0,467 Mẫu Asp 6 27,529 7295 0,483 Giá trị trung bình 27,402 6965 0,484 %RSD 1,071 11,280 3,324 Max 27,529 7671 0,508 Min 26,803 5422 0,467 SD 0,294 786 0,016
Kết quả xác định Giới hạn phát hiện của thiết bị đối với saccharin và aspartame được thể hiện trên bảng 3.9.
Bảng 3.9. Giới hạn phát hiện của thiết bị đối với saccharin và aspartame Chất phân tích LOD (ppm) LOQ (ppm) S/N
Saccharin 0,03 0,101 4,63
Aspartame 0,2 0,667 3,3
Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy các giá trị 1,5 < S/N < 10, cho thấy
LOD và LOQ của thiết bị đo đáp ứng tốt yêu cầu phân tích.
3.2.4. Khoảng tuyến tính
Trong phân tích định lượng khi tăng nồng độ chất phân tích đến một giá trị giới hạn nào đó thì quan hệ giữa tín hiệu đo và nồng độ chất phân tích không còn phụ thuộc tuyến tính. Khoảng nồng độ chất phân tích phụ thuộc tuyến tính vào chiều cao hay diện tích pic gọi là khoảng tuyến tính, thường được tính từ giới hạn định lượng đến giới hạn tuyến tính.
Với các điều kiện chạy HPLC đã chọn, chúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic sắc ký vào nồng độ của saccharin và aspartame. Từ dung dịch chuẩn gốc 1000ppm chúng tôi đã pha loãng thành dung dịch chuẩn trung gian 100ppm và sau đó pha thành dãy dung dịch chuẩn làm việc của các chất phân tích với các nồng độ khác nhau rồi tiến hành bơm vào hệ thống HPLC, chạy sắc ký đồ của hỗn hợp chất phân tích trong các điều kiện tối ưu đã lựa chọn ở bảng 3.3. Kết quả phân tích được chỉ ra trên bảng 3.10, hình 3.11, 3.12 và bảng 3.11.
Bảng 3.10. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ chất phân tích Nồng độ SAC
(ppm)
Diện tích pic SAC (mAU)
Nồng độ ASP (ppm)
Diện tích pic ASP (mAU) 0,1 6374 0,5 22,658 0,2 12090 1,0 59,130 0,5 31527 2,0 302,98 1,0 58227 5,0 588,96 2,0 117000 10,0 906,35 5,0 305013 20,0 1231,34 10,0 627550 50,0 2328,79 20,0 1326120 100,0 3552,07 50,0 3119078 100,0 6129352 200,0 12685692
Hình 3.11. Đường chuẩn của saccharin trong khoảng nồng độ 0,2 ÷ 200 ppm
Hình 3.12. Đường chuẩn của aspartam trong khoảng nồng độ 0,5 ÷ 100 ppm Bảng 3.11. Phương trình hồi quy và hệ số tương quan của đường chuẩn Chất phân tích Khoảng nồng độ (ppm) Phương trình hồi quy Hệ số tương quan Saccharin 0,1 – 200 y = 63062x -9149,5 R² = 0,9997 Aspartam 0,5 – 100 y = 15056x + 27,433 R² = 0,9997 y = 63062x - 9149.5 R² = 0.9997 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000 0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0
Diện tích Pic (mAU)
Nồng độ (ppm) y = 15056x + 27.433 R² = 0.9997 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0
Diện tích pic (mAU).107