3. Nội dung nghiên cứu
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy invitro
Các thí nghiệm được đặt trong phòng nuôi cấy ở nhiệt độ 25 ± 2°C, cường độ chiếu sáng 2000 lux, độ ẩm 60 – 80 %, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày. Mỗi thí nghiệm tạo mẫu in vitro cấy 30 mẫu, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.
(i) Tạo mẫu sạch in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của cây Ô đầu
Các bước thí nghiệm được tiến hành như sau:
Đoạn thân mang mắt chồi bên ngâm xà phòng loãng trong 15 - 30 phút sau đó rửa sạch với nước cất.
(1) Đưa mẫu vào bình sạch, rửa lại mẫu bằng nước cất khử trùng.
(2) Khử trùng mẫu bằng cồn 70 % (1 - 2 phút). Rửa mẫu bằng nước cất khử trùng. (3) Khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1 % ở các mức thời gian (3; 5; 7; 9 và 11 phút).
(4) Rửa sạch mẫu bằng nước cất khử trùng 3 lần.
Đoạn thân mang mắt chồi bên sau khi được khử trùng tiến hành cấy vào môi trường MS cơ bản.
Để thấy được ảnh hưởng của loại mẫu cấy đến khả năng phát sinh chồi sau khử trùng. Đánh giá kết quả sau 2 tuần, 4 tuần. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ đoạn
thân nhiễm (%); Tỷ lệ đoạn thân sạch phát sinh chồi (%); Tỷ lệ đoạn thân không sạch phát sinh chồi; Chất lượng chồi.
Các bước khử trùng được thực hiện trong môi trường vô trùng.
(ii) Phương pháp tạo đa chồi từ nguồn mẫu sạch thu được
Ảnh hưởng riêng rẽ của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến khả năng phát sinh chồi
Để thăm dò ảnh hưởng riêng rẽ của chất kích thích sinh trưởng đến sự phát sinh đa chồi ở cây Ô đầu, Các công thức môi trường nuôi cấy đều sử dụng môi trường MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/l + agar 9,0g/l và các chất kích thích sinh trưởng có hàm lượng thay đổi. Công thức đối chứng sử dụng là môi trường MS cơ bản + sucrose 30 g/l + agar 9,0 g/l không bổ sung các chất kích thích sinh trưởng [20]. Ở mỗi công thức nuôi cấy tiến hành trên 6 bình (30 mẫu cấy).
(1) Các đoạn thân mang mắt chồi bên được cấy trên môi trường MS cơ bản + sucrose 30g/l + agar 9,0g/l + bổ sung BAP với nồng độ 0,5 mg/l; 1 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l; tương ứng với các công thức từ 1 - 4.
(2) Các đoạn thân mang mắt chồi bên được cấy trên môi trường MS cơ bản + sucrose 30g/l + agar 9,0g/l + bổ sung kinetin với nồng độ 0,5 mg/l; 1 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l tương ứng với các công thức từ 1 - 4.
Kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng ở cây Ô đầu sau các thời gian: 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần nuôi cấy qua các chỉ tiêu theo dõi sau: Số chồi/mẫu; Chiều cao chồi (cm); Số lá/chồi; Chất lượng chồi.
Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá to màu xanh đậm (+++) Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi nhỏ, lá xanh (++)
Chồi sinh trưởng kém: Chồi nhỏ, lá nhỏ màu xanh nhạt (+)
(iii) Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh
Khi các chồi cây Ô đầu đạt chiều cao 3 – 4 cm và có 3 - 5 lá được cấy chuyển sang môi trường ra rễ. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30
mẫu. Môi trường thí nghiệm thăm dò là MS cơ bản + sucrose 30 g/l + aga 9 g/l + α-NAA nồng độ 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l hoặc IBA nồng độ 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l. Theo dõi, đánh giá kết quả sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần.
Các chỉ tiêu theo dõi: Số rễ/chồi; Chiều dài rễ (cm); Chất lượng rễ Rễ tốt: Rễ mập, khỏe, dài, màu trắng sữa hoặc trắng xanh (+++) Rễ trung bình: Rễ khỏe, màu trắng xanh (++)
Rễ kém: Rễ nhỏ, ngắn, màu trắng (+)
(iv) Đưa cây ra vườn ươm
Thí nghiệm ngoài vườn ươm được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần 30 mẫu.
Giai đoạn vườn ươm
Các chồi đơn đạt chiều cao 4 – 5 cm, mọc 4 - 5 lá, có 2 - 3 rễ, chiều dài rễ đạt 3 – 4 cm, rễ mập đủ tiêu chuẩn đưa cây ra ngoài vườn ươm.
Cách bố trí thí nghiệm: thăm dò trên 3 loại giá thể: (1) Đất phù sa
(2) Đất phù sa + trấu hun (tỉ lệ 1:1) (3) Đất thịt trung bình.
Hai tuần đầu tiên để cây ở điều kiện phòng. Tuần thứ ba bắt đầu đưa cây ra nhà lưới. Tưới phun dưới dạng sương mù vào lúc sáng sớm. Theo dõi chỉ tiêu đánh giá sau 2 tuần, 4 tuần: Tỷ lệ sống (%); Chất lượng cây.
Cây phát triển tốt: Cây to, cao, phiến lá rộng, lá xanh đậm (+++) Cây phát triển trung bình: Cây thấp, lá xanh đậm ++
Cây phát triển kém: Cây nhỏ, thấp, lá nhỏ, lá xanh nhạt (+)